Gli autori ringraziano Linda Turner per l&#39;assistenza con la preparazione microbiologica. RZ e LGW sono stati finanziati dall&#39;Istituto Rowland ad Harvard e CGB è stato finanziato come studioso di una Fondazione CAPES, Scienza Senza Frontiere Programma, Brasile (Processo # 7340-11-7)

1. Setup and Data Acquisition <ol><li> Far crescere una cultura di Streptococcus ceppo V4051-197 (nuoto liscio), le cellule in KTY medio da congelato magazzino 22. Incubare in un agitatore rotativo notte a 35 ° C e 150 rpm, a saturazione. </li><li> Inoculare 10 ml di mezzo fresco KTY con 500 microlitri della cultura satura. Incubare per un ulteriore 3,5 ore a 35 ° C e 150 rpm fino a quando le cellule raggiungono una densità ottica di circa 1,0 a λ = 600 nm (circa 5 x 10 8 cellule / ml). </li><li> Diluire 1:400 in mezzi freschi per ottenere la concentrazione finale di cellule mobili. </li><li> Su un vetrino da microscopio, fare un anello di grasso (per esempio da una siringa riempita di vaselina) di circa 1 mm di altezza e una goccia della soluzione campione al centro. Inserire un vetro di copertura sulla parte superiore e premere leggermente ai bordi per sigillare quella che liquido è in contatto sia con vetrino e coprioggetto. La camera del campione risultante dovrebbe essere around 100-200 micron di profondità. </li><li> Posizionare la camera di campione nel microscopio con il vetro di copertura rivolto verso il basso, e con attenzione, per evitare la formazione di bolle d&#39;aria nell&#39;olio tra vetro e lente. </li><li> Fuoco il microscopio sulla superficie inferiore della camera del campione, e portare il condensatore a concentrarsi. </li><li> Spegnere l&#39;illuminazione standard e posizionare la testina LED dietro l&#39;apertura del condensatore del microscopio. Impostare il LED di alimentazione alla massima potenza. </li><li> Chiudere l&#39;apertura del condensatore a sua misura massima e, se necessario, spostare il LED relativo supporto fino a quando l&#39;illuminazione è centrata sul diaframma lente dell&#39;obiettivo. </li><li> Accendere il computer e la macchina fotografica, e reindirizzare tutta la luce alla porta macchina fotografica del microscopio. Regolare il frame rate e la dimensione dell&#39;immagine nel software di acquisizione immagini. </li><li> Rendere il tempo di esposizione telaio il più breve possibile, pur mantenendo un buon contrasto. Controllare un&#39;intensità istogramma dell&#39;immagine per assicurare che l&#39;immagine non è saturated o sottoesposta. </li><li> Se necessario, riorientare il microscopio in modo tale oggetto di interesse è leggermente sfocato (tipicamente del 10-30 micron). L&#39;oggetto e il piano focale dovrebbe essere nello stesso mezzo (cioè il piano focale dovrebbe trovarsi all&#39;interno della camera del campione). </li></ol> 2. Ricostruzione Il primo passo di elaborazione dati è riorientare numericamente un fotogramma video di una serie di diverse profondità, producendo una pila di immagini. Software di facile utilizzo per fare questo possono essere trovate qui: <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> insieme a esempio immagini (acquisite utilizzando un microscopio invertito, e una immersione in olio lente obiettivo 60X) e un file di scena per il raggio tracciato rendering. <ol><li> Inserire il telaio di interesse e rispettiva background come file immagine separati, nelle caselle relative sull&#39;interfaccia. Una immagine di sfondo è una cornice che fAirly rappresenta lo sfondo del video, in assenza dell&#39;ologramma, e verrà utilizzato per sopprimere qualsiasi rumore schema fisso che potrebbe interferire con la localizzazione ologramma e analisi. </li><li> Inserire i valori nelle caselle di impostazioni globali sul lato sinistro dello schermo prima di eseguire il programma. I primi tre sono i parametri dello stack di uscita: la posizione assiale del primo telaio (&#39;Start focus&#39;), numero di strati dello stack ricostruita (&#39;Numero di passi&#39;); distanza assiale tra ogni fetta dello stack (&#39;Step size&#39;) . </li><li> Per ricostruire oggetti con le giuste proporzioni, la dimensione del passo dovrebbe essere la stessa dimensione della spaziatura tra pixel laterale. Immettere la frequenza di campionamento laterale della fotocamera (spaziatura 1/pixel) nella casella &#39;Pixel / micron&#39;, la lunghezza d&#39;onda illuminazione e indice di rifrazione medio negli ultimi due caselle. Valori di default del programma sono appropriate per ricostruire i dati di esempio. </li><li> Premere il tasto &#39;Flip Z-gradient&#39; se il centro del object è scuro in ologramma (vedi esempio telaio 2005 e la sezione di discussione per maggiori dettagli). </li><li> Controllare il filtro passa-banda sullo stato / off (di default è on). Questo filtro passabanda opzionale, situata in una scatola sotto l&#39;interruttore gradiente-flip, è responsabile per la soppressione del contributo di pixel rumorosi. Il filtro passa-banda è applicato ad ogni fetta immagine immediatamente dopo generazione. </li><li> Controllare l&#39;interruttore di uscita intermedia stati on / off (di default è on). Fasi di analisi intermedia sono scritti in due video in uscita, come non compresso file avi:. Il primo è lo stack riorientato (nome file che termina in &#39;_stack.avi&#39;), il secondo è lo stack dopo l&#39;operazione gradiente assiale (nome file che termina in &#39; _gradient.avi &#39;). Idealmente, questo secondo pila conterrà l&#39;oggetto di interesse ha evidenziato come un oggetto luminoso su uno sfondo scuro. </li><li> Dopo aver impostato tutti i parametri, premere &#39;Run&#39; nella finestra principale. La cornice selezionata viene visualizzata nel riquadro principale del software. </li><li> Utilizzare l&#39;ingrandimento strumento di vetro trovato nella barra degli strumenti a sinistra l&#39;immagine per ingrandire (click sinistro) e zoom out (Shift + click sinistro). Utilizzare lo strumento rettangolo sulla barra degli strumenti per selezionare una regione di interesse (ROI). Cattura il maggior numero di frange del ologramma possibile all&#39;interno del rettangolo, in modo da ottimizzare la ricostruzione. </li><li> Premere il tasto &#39;Processo&#39; per generare i due stack di immagine. Ispezionare le pile risultanti utilizzando ImageJ (che può essere ottenuto gratuitamente presso <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Se l&#39;oggetto di interesse può essere chiaramente visto nella pila di immagini gradiente, procedere al passaggio successivo per estrarre le coordinate dell&#39;oggetto. </li></ol> 3. Rendering <ol><li> Oltre telaio rifocalizzazione, questo programma può individuare la x, y, z coordinate per ogni voxel in oggetto di interesse. Premere il pulsante &#39;Feature Extraction&#39; per abilitare questa funzione. </li><li> Immettere un percorso, inclusa l&#39;estensione (per esempio: c: home output.inc), per ilUscita coordinate file. Selezionare &#39;stile POV-Ray&#39; nella casella &#39;stile coordinata di uscita&#39;. Questo fa sì che il programma di scrivere un file oggetto che può essere visualizzato utilizzando il pacchetto software raytracing libero POV-Ray (che può essere ottenuto da <a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/</a> ). </li><li> Rielaborare le immagini come al precedente punto 2. Il programma fornirà una serie di (x, y, z) coordina nel ROI selezionata, scritto nel nome del file nella &#39;uscita coordinate&#39; box. Estrazione di coordinate dell&#39;oggetto richiede molto più tempo rispetto alla generazione stack. </li><li> Assicurarsi che il file POV-Ray campione (fornito con il codice ricostruzione) si trova nella stessa cartella il file delle coordinate appena generati. Modificare il file pov di esempio. E sostituire il nome del file tra virgolette sulla linea # Include &quot;MYFILE.inc&quot; , con il nome del file di dati generati dalla ricostruzione del codice. </li><li> Fare clic sul pulsante &#39;Esegui&#39; in POV-Ray per il rendering di un&#39;immagine bitmap. Tegli posizione della telecamera, l&#39;illuminazione e le opzioni di texture sono solo alcune delle personalizzazioni possibili in POV-Ray, vedere la documentazione in linea per i dettagli. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il passo più importante in questo protocollo sperimentale è la cattura accurata di immagini da un setup sperimentale stabile. Con scarsi dati di base, ad alta ricostruzione fedeltà è quasi impossibile. E &#39;anche importante evitare lenti dell&#39;obiettivo con un elemento di contrasto di fase interna (visibile come un anello scuro quando guardando attraverso il posteriore dell&#39;obiettivo), in quanto questo può degradare l&#39;immagine ricostruita. L&#39;oggetto di interesse deve essere sufficientemente lontana...

Linea digitale microscopia olografica (DIHM) permette veloce l&#39;imaging tridimensionale di campioni microscopici, quali microrganismi nuoto 1,2 e sistemi di materia morbidi 3,4, con modifiche minime a una configurazione microscopio standard. In questo documento viene fornita una dimostrazione pedagogica di DIHM, incentrata su software sviluppato nel nostro laboratorio. Questo documento contiene una descrizione di come impostare il microscopio, ottimizzare l&#39;acquisizione dei dati, ed elaborare le immagini registrate per ricostruire i dati tridimensionali. Il software (basato in parte su software sviluppato dalla DG Grier e altri 5) e immagini di esempio sono disponibili gratuitamente sul nostro sito web. Fornire una descrizione dei passaggi necessari per configurare il microscopio, ricostruire i volumi tridimensionali da ologrammi e rendere i volumi risultanti di interesse utilizzando un raggio gratuito tracing pacchetto software. L&#39;articolo si conclude con una discussione di fattori che incidono sulla qualità della ricostruzione, E un confronto di DIHM con metodi concorrenti. Anche se DIHM stato descritto qualche tempo fa (per una revisione generale dei suoi principi e sviluppo, vedi Kim 6), la potenza di calcolo necessaria e la competenza di elaborazione delle immagini hanno sinora in gran parte limitato l&#39;uso di gruppi di ricerca specializzati con una particolare attenzione allo sviluppo dello strumento. Questa situazione sta cambiando alla luce dei recenti progressi nella tecnologia informatica e fotocamera. Computer desktop moderni possono facilmente far fronte con la trasformazione e sui requisiti di archiviazione dati; telecamere CCD o CMOS sono presenti nella maggior parte dei laboratori di microscopia e del software necessario è effettuata liberamente disponibile su internet da gruppi che hanno investito tempo nello sviluppo della tecnica. Vari sistemi sono stati proposti per l&#39;imaging la configurazione di oggetti microscopici in un volume di campione tridimensionale. Molti di questi sono tecniche di scansione 7,8, in cui una pila di immagini viene registrata dalla mechanically tradurre il piano dell&#39;immagine attraverso il campione. Confocale a scansione microscopia a fluorescenza è forse l&#39;esempio più familiare. Tipicamente, un colorante fluorescente viene aggiunto a un oggetto fase per raggiungere un livello accettabile di contrasto campione, e la disposizione confocale utilizzato per localizzare spazialmente emissione fluorescente. Questo metodo ha portato a progressi significativi, per esempio nel campo della scienza colloidale in cui è consentito l&#39;accesso alla dinamica tridimensionale di sistemi affollati 9-11. L&#39;uso di etichettatura è una differenza importante tra la microscopia confocale e DIHM, ma le altre caratteristiche delle due tecniche sono paragonabili. DIHM ha un vantaggio significativo in velocità che l&#39;apparecchio ha parti in movimento. Gli specchi a scansione meccanica in sistemi confocale pongono un limite superiore sul tasso di acquisizione dei dati - in genere circa 30 fotogrammi / sec per immagine pixel a 512 x 512. Una pila di tali immagini da diversi piani focali può essere ottenuta con fisicamente transldall&#39;uso della fase del campione o lente obiettivo tra i fotogrammi, portando ad una velocità di acquisizione finale di circa un volume al secondo per uno stack frame 30. In confronto, un sistema olografico basato su una moderna fotocamera CMOS in grado di catturare 2.000 fotogrammi / sec con le stesse dimensioni e la risoluzione dell&#39;immagine, ogni fotogramma viene elaborato `in linea &#39;per dare uno snapshot indipendente dal volume del campione. Per ribadire: campioni fluorescenti non sono richiesti per DIHM, anche se un sistema è stato sviluppato che esegue la ricostruzione olografica di un soggetto fluorescente 12. Nonché informazioni sul volume tridimensionale, DIHM può anche essere utilizzato per fornire immagini a contrasto di fase quantitative 13, ma che non rientra nell&#39;ambito della discussione qui. Immagini di dati Raw DIHM sono bidimensionali, e per certi aspetti sembrano immagini al microscopio normali, anche se fuori fuoco. La differenza principale tra DIHM e microscopia a campo luminoso norma risiede negli anelli di diffrazione che circondano oggetti in il campo visivo; questi sono a causa della natura della illuminazione. DIHM richiede una fonte più coerente del campo luminoso - tipicamente un LED o laser. Gli anelli di diffrazione nell&#39;ologramma contengono le informazioni necessarie per ricostruire una immagine tridimensionale. Ci sono due approcci principali per l&#39;interpretazione dei dati DIHM; rifocalizzazione montaggio e numerica diretta. Il primo approccio è applicabile nei casi in cui la forma matematica del modello di diffrazione è noto in anticipo 3,4; questa condizione è soddisfatta da una piccola manciata di oggetti semplici come sfere, cilindri, e ostacoli mezzo aereo. Raccordo diretto si applica anche nei casi in cui la posizione assiale dell&#39;oggetto è noto, e l&#39;immagine può essere montato utilizzando una tabella di look-up di modelli di immagini 14. Il secondo approccio (rifocalizzazione numerico) è invece più generale e si basa sull&#39;utilizzo degli anelli di diffrazione dell&#39;immagine ologramma bidimensionale a ricostruire numericamente il campo otticoun numero di (arbitrariamente distanziati) piani focali in tutto il volume del campione. Esistono diversi metodi correlati per fare questo 6; questo lavoro utilizza il Rayleigh-Sommerfeld indietro tecnica di propagazione come descritto da Lee e Grier 5. L&#39;esito di questa procedura è una pila di immagini che riproducono l&#39;effetto di modificare manualmente il piano focale del microscopio (da qui il nome `rifocalizzazione numerica &#39;). Una volta che è stata generata una pila di immagini, la posizione del soggetto nel volume focale deve essere ottenuta. Una serie di euristica di analisi delle immagini, come ad esempio la varianza intensità locale o contenuto di frequenza spaziale, sono stati presentati per quantificare la nitidezza di messa a fuoco in diversi punti del campione 15. In ogni caso, quando una particolare metrica immagine è ingrandita (o minimizzata), l&#39;oggetto è considerato a fuoco. A differenza di altri programmi che cercano di identificare un piano focale particolare se un oggetto è &#39;a fuoco&#39;, il metodo in questo lavoro individua points che si trovano dentro l&#39;oggetto di interesse, che possono giungere attraverso una vasta gamma di piani focali. Questo approccio si applica ad una vasta gamma di argomenti ed è particolarmente adatto per estesi, campioni debolmente-Scattering (oggetti fase), come colloidi astiformi, catene di batteri o flagelli eucariotici. In tali campioni il contrasto dell&#39;immagine cambia quando l&#39;oggetto passa attraverso il piano focale; un&#39;immagine sfocata ha un centro luce se l&#39;oggetto è su un lato del piano focale e un centro scuro se è dall&#39;altra. Oggetti pura fase hanno poco o nessun contrasto quando esse si trovino esattamente nel piano focale. Questo fenomeno di inversione contrasto è stato discusso da altri autori 16,17 ed è infine dovuto alla fase Gouy anomalia 18. Questo è stato introdotto in forma più rigorosa nel contesto di olografia altrove, dove vengono valutati i limiti della tecnica, la tipica incertezza in posizione è dell&#39;ordine di 150 nm (circa un pixel) in EACh direzione 19. Il metodo della fase anomalia Gouy è uno dei pochi regimi DIHM ben definiti per determinare la struttura di oggetti estesi in tre dimensioni, ma comunque alcuni oggetti sono problematici per ricostruire. Gli oggetti che si trovano direttamente lungo l&#39;asse ottico (indicando la telecamera) sono difficili da ricostruire con precisione, incertezze nella lunghezza e la posizione dell&#39;oggetto diventano grandi. Questa limitazione è in parte dovuta alla profondità bit ristretta dei pixel di registrazione dell&#39;ologramma (il numero di livelli di grigio distinti che la fotocamera può registrare). Un&#39;altra configurazione problematica si verifica quando l&#39;oggetto di interesse è molto vicino al piano focale. In questo caso, le immagini reali e virtuali dell&#39;oggetto sono ricostruiti in prossimità, dando luogo a campi ottici complessi che sono difficili da interpretare. Un secondo, leggermente meno importante preoccupazione qui è che le frange di diffrazione risultanti occupano meno del sensore di immagine, e questo inf grossolana graniormazione porta ad una ricostruzione più povera qualità. In pratica, un filtro gradiente semplice viene applicato ai volumi ricostruiti tridimensionali per rilevare forti inversioni intensità lungo la direzione di illuminazione. Regioni dove l&#39;intensità cambia rapidamente dal chiaro allo scuro, o viceversa, vengono quindi associati con le regioni di scattering. Oggetti debolmente di scattering sono ben descritti come una collezione non interagenti di tali elementi 20, questi contributi individuali somma per dare il campo diffuso totale che è facilmente invertita utilizzando il retro metodo di propagazione di Rayleigh-Sommerfeld. In questo lavoro, l&#39;intensità tecnica gradiente assiale viene applicato a una catena di cellule Streptococcus. I corpi cellulari sono oggetti di fase (la specie E. coli ha un indice di rifrazione misurato 21 per essere 1.384 alla lunghezza d&#39;onda λ = 589 nm; ceppo Streptococcus è probabilmente simili) e appaiono come una catena ad alta intensità di blob collegati in thè stata applicata e volume del campione dopo il filtro gradiente. Soglia e includono metodi di estrazione standard applicati a questo volume filtrato consentono l&#39;estrazione di pixel volumetrici (voxel) corrispondenti alla regione all&#39;interno delle cellule. Un particolare vantaggio di questo metodo è che permette la ricostruzione non ambigua di posizione di un oggetto in direzione assiale. Metodi simili (almeno, quelli che registrano ologrammi vicino all&#39;oggetto, impressi attraverso un obiettivo microscopio) soffrono di essere in grado di determinare il segno di questo spostamento. Anche se il metodo di ricostruzione Rayleigh-Sommerfeld è anche l&#39;accesso indipendente in questo senso, l&#39;operazione di sfumatura permette di discriminare tra oggetti deboli fase sopra e sotto il piano focale.

<table><tbody><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td><td>Nikon Corp.</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>M660L3</td><td>emission wavelength &amp;lambda;=660 nm, linewidth approximately 20 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LED power supply</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thread Adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM2T2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thread Adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Frame Grabber board</td><td>EPIX</td><td>PIXCI E4</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>High-Speed CMOS camera</td><td>Mikrotron</td><td>MC-1362</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Oggetti debolmente di scattering, come piccole particelle colloidali e la maggior parte delle cellule biologiche, si incontrano spesso in microscopia. Infatti, una serie di tecniche sono state sviluppate per visualizzare meglio questi oggetti di fase; contrasto di fase e DIC sono tra i metodi più diffusi per migliorare il contrasto. Tuttavia, la posizione di registrazione e la forma in direzione out-of-imaging-plane rimane difficile. Questa relazione introduce un semplice metodo sperimentale per determinare con precisione la posizione e la geometria di oggetti in tre dimensioni, utilizzando la microscopia olografica digitale inline (DIHM). In generale, il volume del campione accessibile è definita dalla dimensione del sensore telecamera nella direzione laterale, e la coerenza illuminazione nella direzione assiale. Volumi di campione tipiche vanno da 200 micron x 200 micron x 200 micron con illuminazione a LED, per5 millimetri x 5 mm x 5 mm o superiore in illuminazione laser. Questa luce di illuminazione è configurato in modo che le onde piane sono incidenti sul campione. Oggetti nel volume del campione poi diffondono la luce, che interferisce con la luce unscattered per formare modelli di interferenza perpendicolare alla direzione di illuminazione. Questa immagine (l&#39;ologramma) contiene le informazioni profondità richiesta per ricostruzione tridimensionale, e può essere catturata su un dispositivo di imaging quali uno CMOS o CCD. Il metodo Back Propagation Rayleigh-Sommerfeld è impiegato per rifocalizzare numericamente immagini al microscopio, e una semplice euristica di imaging basata sulla fase Gouy anomalia viene utilizzato per identificare spargendo oggetti all&#39;interno del volume ricostruito. Questo metodo semplice e robusto risulta in un, misura univoca senza modello della posizione e forma degli oggetti in campioni microscopici.

Per dimostrare le capacità di DIHM, esperimenti sono stati eseguiti su una catena di batteri Streptococcus. La catena stessa misurato 10,5 millimetri lungo, ed era composta di 6-7 cellule sferico cilindrico (due delle cellule della catena sono vicini a dividere) con diametri nell&#39;intervallo 0,6-1 micron. Figure 1a e 1b mostrano l&#39;interfaccia principale della ricostruzione e del software di rendering. Esempi del procedimento rifocalizzazione numerico si vedono nella <st...

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Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico.

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) dei soggetti debolmente di scattering

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

digital-inline-holographic-microscopy-dihm-weakly-scattering

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.2K Views.  Harvard University.  Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico. 

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Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

Senza lenti microscopia a fluorescenza su un chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Ricerca

Bioingegneria

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope for MEMS Inspection and Characterization

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and automotive. However, effective inspection and characterization metrology systems are needed to ensure the functional reliability of MEMS. This study presents a system based on digital holography as a tool for MEMS metrology. Digital holography has gained increasing attention in the past 20 years. With the fast development and decreasing cost of sensor arrays, resolution of such systems has increased broadening potential applications. Thus, it has attracted attention from both research and industry sides as a potential reliable tool for industrial metrology. Indeed, by recording the interference pattern between an object beam (which contains sample height information) and a reference beam on a CCD camera, one can retrieve the quantitative phase information of an object. However, most of digital holographic systems are bulky and thus not easy to implement on industry production lines. The novelty of the system presented is that it is lens-less and thus very compact. In this study, it is shown that the Compact Digital Holographic Microscope (CDHM) can be used to evaluate several characteristics typically consider as criteria in MEMS inspections. The surface profiles of MEMS in both static and dynamic conditions are presented. Comparison with AFM is investigated to validate the accuracy of the CDHM.

We present a compact reflection digital holographic system (CDHM) for inspection and characterization of MEMS devices. A lens-less design using a diverging input wave providing natural geometrical magnification is demonstrated. Both static and dynamic studies are presented.

Lens-meno compatta digitale olografico microscopio per MEMS di ispezione e caratterizzazione

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and ...

Ingegneria

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and nanotechnology. Although near-field scanning microscopy and superlenses have improved the resolution in the near-field region, far-field imaging in real-time remains a significant challenge. Recently, the hyperlens, which magnifies and converts evanescent waves into propagating waves, has emerged as a novel approach to far-field imaging. Here, we report the fabrication of a spherical hyperlens composed of alternating silver (Ag) and titanium oxide (TiO2) thin layers. Unlike a conventional cylindrical hyperlens, the spherical hyperlens allows for two-dimensional magnification. Thus, incorporation into conventional microscopy is straightforward. A new optical system integrated with the hyperlens is proposed, allowing for a sub-wavelength image to be obtained in the far-field region in real time. In this study, the fabrication and imaging setup methods are explained in detail. This work also describes the accessibility and possibility of the hyperlens, as well as practical applications of real-time imaging in living cells, which can lead to a revolution in biology and nanotechnology.

The use of a hyperlens has been regarded as a novel super-resolution imaging technique due to its advantages in real-time imaging and its simple implementation with conventional optics. Here, we present a protocol describing the fabrication and imaging applications of a spherical hyperlens.

Dimostrazione di un microscopio Hyperlens-integrato e super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Immunologia e infezioni

Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living cells. The proposed instrument extends the sensitivity of label-free optical microscopy to nanoscale changes in organelle size and shape and can be used to accelerate the study of the structure-function relationship pertaining to organelle dynamics underlying fundamental biological processes, such as programmed cell death or cellular differentiation. The microscope can be easily implemented on existing microscopy platforms, and can therefore be disseminated to individual laboratories, where scientists can implement and use the proposed methods with unrestricted access.
The proposed technique is able to characterize subcellular structure by observing the cell through two-dimensional optical Gabor filters. These filters can be tuned to sense with nanoscale (10's of nm) sensitivity, specific morphological attributes pertaining to the size and orientation of non-spherical subcellular organelles. While based on contrast generated by elastic scattering, the technique does not rely on a detailed inverse scattering model or on Mie theory to extract morphometric measurements. This technique is therefore applicable to non-spherical organelles for which a precise theoretical scatter description is not easily given, and provides distinctive morphometric parameters that can be obtained within unstained living cells to assess their function. The technique is advantageous compared with digital image processing in that it operates directly on the object's field transform rather than the discretized object's intensity. It does not rely on high image sampling rates and can therefore be used to rapidly screen morphological activity within hundreds of cells at a time, thus greatly facilitating the study of organelle structure beyond individual organelle segmentation and reconstruction by fluorescence confocal microscopy of highly magnified digital images of limited fields of view.
In this demonstration we show data from a marine diatom to illustrate the methodology. We also show preliminary data collected from living cells to give an idea of how the method may be applied in a relevant biological context.

We demonstrate a dark-field microscopy method based on Gabor-like filtering to measure subcellular dynamics within single living cells. The technique is sensitive to alterations in the structure of organelles, such as mitochondrial fragmentation.

Scatter microscopia ottica Sulla base bidimensionale Filtri di Gabor

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living ...

Biologia

Uncovering Hidden Dynamics of Natural Photonic Structures Using Holographic Imaging

In this method, the potential of optics and holography to uncover hidden details of a natural system's dynamical response at the nanoscale is exploited. In the first part, the optical and holographic studies of natural photonic structures are presented as well as conditions for the appearance of the photophoretic effect, namely, the displacement or deformation of a nanostructure due to a light-induced thermal gradient, at the nanoscale. This effect is revealed by real-time digital holographic interferometry monitoring the deformation of scales covering the wings of insects induced by temperature. The link between geometry and nanocorrugation that leads to the emergence of the photophoretic effect is experimentally demonstrated and confirmed. In the second part, it is shown how holography can be potentially used to uncover hidden details in the chemical system with nonlinear dynamics, such as the phase transition phenomenon that occurs in complex oscillatory Briggs-Rauscher (BR) reaction. The presented potential of holography at the nanoscale could open enormous possibilities for controlling and molding the photophoretic effect and pattern formation for various applications such as particle trapping and levitation, including the movement of unburnt hydrocarbons in the atmosphere and separation of different aerosols, decomposition of microplastics and fractionation of particles in general, and assessment of temperature and thermal conductivity of micron-size fuel particles.

The paper is primarily focused on the combined power of optical (linear and nonlinear) and holographic methods used to reveal phenomena at the nanoscale. The results obtained from the biophotonic and oscillatory chemical reactions' studies are given as representative examples, highlighting holography's ability to reveal dynamics at a nanoscale.

Scoprire le dinamiche nascoste delle strutture fotoniche naturali utilizzando l'imaging olografico

In this method, the potential of optics and holography to uncover hidden details of a natural system's dynamical response at the nanoscale is exploited. ...

Chimica

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

Quantificare i microrganismi alle concentrazioni basse usando microscopia digitale oleografica (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Una guida per costruire un altamente propenso spazzato Tile microscopio per l'esteso campo di vista singola molecola Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.