Die Autoren danken Linda Turner für die Unterstützung bei mikrobiologischen Herstellung. RZ und LGW wurden vom Rowland Institute der Harvard und CGB finanziert wurde als CAPES Stiftung Gelehrte, Wissenschaft ohne Grenzen Programm, Brasilien (Verfahren Nr. 7340-11-7) gefördert

1. Setup-und Datenkommunikation <ol><li> Wachsen einer Kultur von Streptococcus-Stamm V4051-197 (glatte Schwimmen) Zellen in KTY Medium aus der Tiefkühl 22. Inkubieren in einem Rundschüttler über Nacht bei 35 ° C und 150 UpM bis zur Sättigung. </li><li> Beimpfen von 10 ml frischem KTY Medium mit 500 &amp;mgr; l der gesättigten Kultur. Inkubation für weitere 3,5 h bei 35 ° C und 150 Upm, bis die Zellen erreichen eine optische Dichte von etwa 1,0 bei λ = 600 nm (etwa 5 x 10 8 Zellen / ml). </li><li> Verdünnt 1:400 in frischem Medium auf eine Endkonzentration von beweglichen Zellen zu erhalten. </li><li> Auf einen Objektträger, einen Ring von Fett (zB aus einer Spritze mit Vaseline gefüllten) um 1 mm in der Höhe und einen Tropfen der Probenlösung in der Mitte. Legen Sie ein Deckglas oben und drücken Sie leicht an den Kanten zu versiegeln, sicherzustellen, dass die Flüssigkeit in Kontakt mit beiden Träger und Deckglas. Die daraus resultierende Probenkammer sollte arou seinnd 100-200 um in die Tiefe. </li><li> Setzen Sie die Probenkammer im Mikroskop mit dem Deckglas nach unten, und vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen in dem Öl zwischen Glas und Linse zu verhindern. </li><li> Fokussierung des Mikroskops auf der Bodenfläche der Probenkammer, und bringen den Kondensator zu konzentrieren. </li><li> Schalten Sie die Standardbeleuchtung und legen Sie den LED-Kopf hinter dem Kondensator Apertur des Mikroskops. Stellen Sie die LED-Stromversorgung für maximale Leistung. </li><li> Schließen Kondensorapertur in vollem Umfang, und wenn nötig, verschieben die Leuchtdiode in der Halterung, bis die Beleuchtung auf der Objektivlinse Öffnung mittig. </li><li> Schalten Sie den Computer und der Kamera, und leiten alles Licht, um Kamera-Anschluss des Mikroskops. Passen Sie die Bildrate und die Bildgröße in der Bildaufnahme-Software. </li><li> Machen Sie den Bild-Belichtungszeit so kurz wie möglich unter Beibehaltung guten Kontrast. Überprüfen einer Bildintensitätshistogramm, um sicherzustellen, dass das Bild nicht saturaTED-oder unterbelichtet. </li><li> Wenn nötig, neu auszurichten, so dass das Mikroskop Objekt von Interesse leicht (in der Regel von 10 bis 30 um) defokussiert. Das Objekt und der Brennebene sollten im gleichen Medium (dh die Brennebene sollten innerhalb der Probenkammer liegen). </li></ol> 2. Wiederaufbau Der erste Schritt der Datenverarbeitung ist die numerisch refokussieren ein Videobild in einer Reihe von verschiedenen Tiefen, wodurch ein Stapel von Bildern. : Benutzerfreundliche Software, dies zu tun finden Sie hier <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> zusammen mit B. Bilder (mit einem inversen Mikroskop erfasst und einem 60X Ölimmersions-Objektiv) und eine Szene-Datei für Raytracing Rendering. <ol><li> Eingang der Rahmen von Interesse und deren jeweiligen Hintergrund als separate Bilddateien in die entsprechenden Felder auf der Schnittstelle. Ein Hintergrundbild ist ein Rahmen, fairly stellt den Hintergrund des Videos, in Abwesenheit des Hologramms, und wird verwendet, um eine Festmusterrauschen, das mit dem Hologramm Lokalisierung und Analyse stören könnten, zu unterdrücken. </li><li> Werte eingeben, bevor Sie das Programm in den globalen Einstellungen Boxen auf der linken Seite des Bildschirms. Die ersten drei sind Stack-Parameter Ausgang: Axial Position des ersten Rahmen (&#39;Start Fokus&#39;), Anzahl der Scheiben in der rekonstruierten Stapel (&#39;Anzahl der Schritte&#39;); axiale Abstand zwischen jeder Scheibe im Stapel (&#39;Schrittweite&#39;) . </li><li> Um Objekte mit den richtigen Proportionen zu rekonstruieren, sollte die Schrittweite die gleiche Größe wie die laterale Pixelabstand sein. Geben Sie der Kamera seitlichen Abtastfrequenz (1/pixel Abstand) in der &#39;Pixel / micron&#39; Box, die Belichtungswellenlänge und mittleren Brechungsindex in den letzten zwei Boxen. Die Standardwerte des Programms sind für die Rekonstruktion der Daten beispielsweise geeignet. </li><li> Drücken Sie die Taste &#39;Flip Z-Gradienten &quot;, wenn der Mittelpunkt der object ist dunkel in dem Hologramm (siehe Beispiel Rahmen 2005 und die Diskussion Abschnitt für weitere Details). </li><li> Überprüfen Sie die Bandpassfilter ein / aus (default ist). Diese optionale Bandpass-Filter, in einer Box unter dem Verlaufs-Flip-Schalter befindet, ist für die Unterdrückung der Beitrag laut Pixel verantwortlich. Der Bandpass-Filter auf jedem Bild Scheibe unmittelbar nach Generation angewendet. </li><li> Überprüfen Sie die Zwischenausgangs Ein-/ Aus-Zustände (Standard ist). Zwischenanalyse Schritte sind in zwei Ausgangsvideos als unkomprimierte geschrieben, avi Dateien:. Ist die erste der neu ausgerichteten Stapel (Dateinamen, die auf &#39;_stack.avi&#39;), der zweite ist der Stapel nach der axialen Gradienten Operation (Dateiname, die auf &#39; _gradient.avi). Im Idealfall wird diese zweite Stapel enthalten das Objekt von Interesse hervorgehoben als ein helles Objekt vor einem dunklen Hintergrund. </li><li> Nach Einstellung aller Parameter, drücken Sie &quot;Ausführen&quot; im Hauptfenster. Der ausgewählte Rahmen wird im Hauptfeld der Software angezeigt. </li><li> Verwenden Sie dieLupe-Werkzeug in der Werkzeugleiste auf der linken Seite das Bild, um es zu vergrößern (linke Maustaste) und verkleinern (Shift + linke Maustaste) gefunden. Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug in der Werkzeugleiste, um eine Region of Interest (ROI) zu wählen. Zu erfassen, wie viele Streifen des Hologramms wie möglich innerhalb des Rechtecks, da dies die Wieder optimieren. </li><li> Drücken Sie die &quot;Process&quot;-Taste, um die beiden Bildstapeln zu generieren. Überprüfen Sie die resultierende Stapel mit ImageJ (die kostenlos zur erhalten werden können <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Wenn das Objekt von Interesse eindeutig im Gradienten Bildstapel gesehen werden, zu dem nächsten Schritt fort, um die Objektkoordinaten zu extrahieren. </li></ol> 3. Rendering <ol><li> Neben Rahmen Neuausrichtung kann dieses Programm finden die x-, y-, z-Koordinaten für jedes Voxel in dem Objekt von Interesse. Drücken Sie die &quot;Feature Extraction&quot;-Taste, um diese Funktion zu aktivieren. </li><li> Geben Sie einen Pfad, einschließlich Erweiterung (zB: c: home output.inc), für dieAusgangskoordinaten-Datei. Wählen Sie &quot;POV-Ray-Stil&quot; in der &quot;Ausgabe-Koordinaten Stil&quot;-Box. Dies bewirkt, dass das Programm auf eine Objektdatei, die mit der kostenlosen POV-Ray Raytracing-Software-Paket (das gewonnen werden kann visualisiert werden kann schreiben <a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/</a> ). </li><li> Nachbearbeiten der Bilder, wie in Abschnitt 2 oben. Das Programm wird eine Reihe von (x, y, z)-Koordinaten in der gewählten ROI, an den Dateinamen in der &quot;Output koordinieren&quot; Feld geschrieben. Extraktion von Objektkoordinaten dauert deutlich länger als Stack-Generation. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Probe POV-Ray-Datei (mit der Rekonstruktion Code geliefert) in dem gleichen Ordner wie die Datei nur Koordinaten erzeugt. Bearbeiten Sie die Probe. Pov-Datei und ersetzen Sie den Dateinamen in Anführungszeichen auf der Linie # Include &quot;MYFILE.inc&quot; mit dem Namen der durch den Rekonstruktionsdatendatei Code generiert. </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Ausführen&quot;-Button in POV-Ray, ein Bitmap-Bild zu machen. Ter Kameraposition, Beleuchtung und Textur-Optionen sind nur einige der Anpassungen in POV-Ray möglich, siehe die Online-Dokumentation. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Der wichtigste Schritt in diesem Versuchsprotokoll ist die genaue Erfassung von Bildern von einer stabilen experimentellen Aufbau. Bei schlechten Hintergrunddaten, ist High-Fidelity-Rekonstruktion unmöglich. Es ist auch wichtig, Objektivlinsen mit einer internen Phasenkontrastelement (als dunkler Kreisring beim Blick durch die Rückseite des Ziels sichtbar ist) zu vermeiden, da dies das rekonstruierte Bild verschlechtern. Das Objekt des Interesses sollte weit genug von der Brennebene, die ein paar Paare von Beugungsstr...

Inline-Digital-holographische Mikroskopie (Dihm) ermöglicht die schnelle dreidimensionale Bildgebung von mikroskopischen Proben, wie Schwimmen Mikroorganismen 1,2 und Soft Matter 3,4 Systeme mit minimalen Änderungen an einer Standard-Mikroskop-Setup. In diesem Papier eine pädagogische Demonstration Dihm vorgesehen ist, um Software in unserem Labor entwickelt zentriert. Dieses Papier enthält eine Beschreibung, wie Sie das Mikroskop, Optimierung der Datenerfassung und Verarbeitung der aufgenommenen Bilder zu dreidimensionalen Daten zu rekonstruieren. Das Software-und beispielsweise Bilder (zum Teil auf Software von der GD Grier und andere entwickelten fünf) sind auf unserer Website frei verfügbar. Eine Beschreibung der notwendigen Schritte, um das Mikroskop zu konfigurieren, zu rekonstruieren dreidimensionale Volumen von Hologrammen und machen die daraus resultierenden Volumina von Interesse mit einem kostenlosen Ray-Tracing-Software-Paket zur Verfügung gestellt. Der Beitrag schließt mit einer Diskussion der Faktoren, die die Qualität der RekonstruktionUnd ein Vergleich der Dihm mit konkurrierenden Verfahren. Obwohl Dihm wurde vor einiger Zeit beschrieben (für eine allgemeine Überprüfung der Grundlagen und Entwicklung, siehe Kim 6), die erforderliche Rechenleistung und Bildverarbeitung Know-how hat sich bisher weitgehend seine Verwendung an Facharbeitsgruppen mit Fokus auf Instrumentenentwicklung beschränkt. Diese Situation ändert sich im Licht der jüngsten Fortschritte in der Computer-und Kameratechnik. Moderne Desktop-Computer kann problemlos mit der Verarbeitung und Datenspeicheranforderungen zu bewältigen; CCD-oder CMOS-Kameras sind in den meisten Labors Mikroskopie vorhanden ist und die erforderliche Software wird frei verfügbar im Internet von Gruppen, die sich Zeit für die Entwicklung, die Technik investiert haben. Verschiedene Schemata sind für die Abbildung der Konfiguration von mikroskopischen Objekten in einem dreidimensionalen Probenvolumen vorgeschlagen. Viele davon sind 7,8-Scan-Techniken, bei dem ein Stapel von Bildern aufgezeichnet wird, indem mechanically Übersetzen der Bildebene durch die Probe. Konfokalen Fluoreszenzmikroskopie ist vielleicht das bekannteste Beispiel. Typischerweise wird ein Fluoreszenzfarbstoff an ein Phasenobjekt, um ein akzeptables Niveau der Probe Kontrast zu erzielen zugegeben und die konfokalen Anordnung verwendet werden, um räumlich zu lokalisieren Fluoreszenzemission. Dieses Verfahren hat erhebliche Fortschritte, beispielsweise in Kolloid-Wissenschaft, wo es Zugang zu den dreidimensionalen Dynamik voll Systeme 9-11 erlaubt geführt. Die Nutzung der Kennzeichnung ist ein wichtiger Unterschied zwischen der konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Dihm, aber auch andere Merkmale der beiden Techniken sind ein Vergleich lohnt sich. Dihm hat einen erheblichen Geschwindigkeitsvorteil, dass die Vorrichtung keine beweglichen Teile. Mechanischen Abtastspiegeln in Konfokalsystemen platzieren eine Obergrenze Datenerfassungsrate - typischerweise um 30 Frames / sec für Pixelbild 512 x 512. Ein Stapel solcher Bilder aus verschiedenen Fokusebenen kann durch physikalisches transl erhalten werdentriebs der Probentisch oder Objektivlinse zwischen den Bildern, die zu einer endgültigen Erfassungsrate von etwa einem Volumen pro Sekunde für eine 30-Frame-Stack. Im Vergleich dazu kann ein holographisches System basierend auf einem modernen CMOS-Kamera 2000 Bildern / sec bei der gleichen Bildqualität und Auflösung zu erfassen, wobei jeder Frame &#39;offline&#39; verarbeitet, um eine unabhängige Snapshot des Volumens der Probe zu geben. Um es zu wiederholen: fluoreszierende Proben nicht für Dihm erforderlich, obwohl ein System entwickelt worden, das holographische Rekonstruktion eines fluoreszierenden Gegenstand 12 führt. Sowie dreidimensionaler Volumeninformation, Dihm kann auch verwendet werden, um quantitative Phasenkontrastaufnahmen 13 vorzusehen, aber das ist nicht Gegenstand des hier diskutierten. Raw-Daten Dihm Bilder sind zweidimensional, und in mancher Hinsicht aussehen wie Standard-Mikroskopbilder, wenn auch unscharf. Der Hauptunterschied zwischen Standard-und Dihm Hellfeldmikroskopie liegt in den Beugungsringen umgeben, die Objekte in das Sichtfeld, das sind durch die Art der Beleuchtung. Dihm erfordert eine kohärentere Quelle als helles Feld - in der Regel eine LED oder Laser. Die Beugungsringe im Hologramm enthält die notwendigen Informationen, um ein dreidimensionales Bild zu rekonstruieren. Es gibt zwei Hauptansätze zur Interpretation Dihm Daten; direkte Montage und numerische Neuausrichtung. Der erste Ansatz ist in Fällen, in denen die mathematische Form des Beugungsmusters wird im Voraus bekannt 3,4 anwendbar, wird dieser Zustand durch eine kleine Handvoll einfache Objekte wie Kugeln, Zylinder und Halbebene Scheide. Direkte Montage ist auch in Fällen, in denen das Objekt axialen Position bekannt ist zutreffend, und das Bild kann unter Verwendung einer Look-up-Tabelle von Bildvorlagen 14 ausgestattet werden. Der zweite Ansatz (numerische Refokussierung) ist eher allgemein und beruht auf der Verwendung der Beugungsringe in dem zweidimensionalen Bildhologramm zur numerischen Rekonstruktion des optischen Feldes aneine Anzahl von (willkürlich) beabstandet Brennebenen der gesamten Probenvolumen. Mehrere verwandte Methoden existieren, dies zu tun 6; diese Arbeit verwendet die Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation-Technik, wie von Lee und Grier 5 beschrieben. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist ein Stapel von Bildern, die die Wirkung der Brennebene des Mikroskops (daher der Name `numerische Neuausrichtung &#39;) manuell ändern zu replizieren. Sobald ein Stapel von Bildern erzeugt worden ist, muss die Position des Objekts in der Brennvolumen erhalten werden. Eine Anzahl von Bildanalyseheuristiken, wie lokale Intensitätsvarianz oder räumliche Frequenzgehalt, wurden vorgestellt, um die Bildschärfe an verschiedenen Stellen in der Probe 15 zu quantifizieren. In jedem Fall, wenn ein bestimmtes Bildmetrik maximiert (oder minimiert), wird das Objekt als im Mittelpunkt. Im Gegensatz zu anderen Systemen, die auf eine bestimmte Brennebene, wo sich ein Objekt &quot;im Fokus&quot; identifizieren zu suchen, das Verfahren in dieser Arbeit holt sich punkte, die in das Objekt von Interesse liegen, die in einem breiten Spektrum von Brennebenen erstrecken kann. Dieser Ansatz ist auf ein breites Spektrum von Themen und eignet sich besonders für ausgedehnte, schwach streuenden Proben (Phase-Objekte), wie stabförmige Kolloide, Ketten von Bakterien oder eukaryotischen Flagellen. In diesen Proben ändert sich die Bildkontrast, wenn das Objekt durch die Fokusebene verläuft, eine defokussierte Bild hat ein Lichtzentrum, wenn das Objekt auf einer Seite der Bildebene und einer dunklen Mitte, wenn es auf der anderen. Reine Phasenobjekte haben wenig bis keinen Kontrast, wenn sie genau in der Brennebene liegen. Dieses Phänomen der Kontrastinversion von anderen Autoren 16,17 diskutiert und letztlich aufgrund der Gouy-Phase Anomalie 18. Dies wurde auf einer strengeren berechtigt im Kontext der Holographie setzen an anderer Stelle, wo die Grenzen der Technik ausgewertet, die typische Unsicherheit in der Position ist, in der Größenordnung von 150 nm (ca. ein Pixel) in each Richtung 19. Die Gouy-Phase Anomalie-Methode ist eine der wenigen gut definierten Dihm Systeme zur Bestimmung der Struktur ausgedehnter Objekte in drei Dimensionen, aber dennoch einige Objekte problematisch zu rekonstruieren sind. Objekte, die direkt entlang der optischen Achse (die auf die Kamera) liegen, sind schwierig genau zu rekonstruieren; Unsicherheiten in der Länge und der Position des Objektes groß werden. Diese Einschränkung ist zum Teil auf die eingeschränkte Farbtiefe der Pixel Aufzeichnung des Hologramms (die Anzahl der verschiedenen Graustufen, die die Kamera aufnehmen kann). Ein weiterer problematischer Konfiguration tritt auf, wenn das Objekt von Interesse ist sehr nahe an der Brennebene. In diesem Fall werden die reale und virtuelle Bilder des Objekts in unmittelbarer Nähe wieder aufgebaut, was zu komplizierte optische Felder, die schwer zu interpretieren sind. Eine zweite, etwas weniger wichtiges Anliegen dabei ist, dass die daraus resultierenden Beugungsstreifen besetzen weniger von der Bildsensor, und das gröbere informationen führt zu einer schlechteren Qualität Wiederaufbau. In der Praxis wird ein einfacher Farbverlauf-Filter, um dreidimensionale rekonstruierten Volumen angewendet starke bis Inversionen entlang der Beleuchtungsrichtung zu erkennen. Regionen, in denen Intensitätsänderungen schnell von hell nach dunkel oder umgekehrt, werden dann mit Streubereiche verbunden. Diese einzelnen Beiträge Summe, um die Gesamtstreufeld, das einfach mit dem Rayleigh-Sommerfeld-Backpropagation-Verfahren invertiert geben; schwach streuenden Objekte sowie eine nicht wechselwirkenden Erhebung solcher Elemente 20 beschrieben. In dieser Arbeit wird die axiale Intensitätsverlauf Technik mit einer Kette von Streptococcus Zellen angelegt. Die Zellkörper sind Phasenobjekte (der Spezies E. coli hat einen Brechungsindex, gemessen 21 bis 1,384 bei einer Wellenlänge λ = 589 nm sein, der Streptococcus-Stamm dürfte ähnlich sein) und erscheinen als ein Hochintensität-Kette von verbundenen Blobs the Probenvolumens nach dem Gradienten-Filter aufgebracht wurde. Standard auf diesem gefilterten Volumen angewendet Schwelle und Merkmalsextraktion Methoden ermöglichen die Extraktion von volumetrischen Pixel (Voxel), die der Region in den Zellen. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es eine eindeutige Rekonstruktion der Position eines Objekts in der axialen Richtung. Ähnliche Verfahren (zumindest diejenigen, die Aufzeichnung von Hologrammen in der Nähe des Objekts durch ein Mikroskopobjektiv abgebildet) leiden darunter, nicht in der Lage, die Zeichen für diese Verschiebung zu bestimmen. Obwohl die Rayleigh-Sommerfeld-Rekonstruktionsverfahren ist auch Zeichen-unabhängige in diesem Sinne ermöglicht die Gradientenbetrieb uns, zwischen schwacher Phasenobjekte oberhalb und unterhalb der Fokusebene zu unterscheiden.

<table><tbody><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td><td>Nikon Corp.</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>M660L3</td><td>emission wavelength &amp;lambda;=660 nm, linewidth approximately 20 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LED power supply</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thread Adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM2T2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thread Adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Frame Grabber board</td><td>EPIX</td><td>PIXCI E4</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>High-Speed CMOS camera</td><td>Mikrotron</td><td>MC-1362</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Schwach streuende Objekte, wie beispielsweise kleine kolloidale Partikel und die meisten biologischen Zellen, sind in der Mikroskopie häufig angetroffen. In der Tat eine Reihe von Techniken entwickelt worden, um diese Phase Objekte besser zu visualisieren, Phasenkontrast und DIC gehören zu den beliebtesten Methoden zur Verbesserung der Kontrast. Jedoch bleibt Aufzeichnungs Position und Form in der Richtung außerhalb der Abbildungsebene herausfordernd. Dieser Bericht stellt eine einfache experimentelle Methode, um die Position und Geometrie der Objekte in drei Dimensionen genau zu bestimmen, mit digitalen Inline-holographische Mikroskopie (Dihm). Grob gesagt, ist die zugängliche Probenvolumen von der Kamera Sensorgröße in der seitlichen Richtung und der Beleuchtungskohärenz in axialer Richtung definiert. Typische Probenvolumina reichen von 200 um x 200 um x 200 um unter Verwendung LED-Beleuchtung, um5 mm x 5 mm x 5 mm oder mehr unter Verwendung von Laserbeleuchtung. Dieses Beleuchtungslicht wird so konfiguriert, daß ebene Wellen treffen auf die Probe. Objekte im Probenvolumen dann streuen Licht, das mit dem nicht gestreuten Licht stört den Interferenzmuster senkrecht zur Beleuchtungsrichtung bilden. Dieses Bild (das Hologramm) enthält den Tiefeninformationen für dreidimensionale Rekonstruktion erforderlich und kann auf einem Standard-Bildgebungsvorrichtung, wie eine CMOS-oder CCD-Kamera aufgenommen werden. Die Rayleigh-Sommerfeld-Backpropagation-Verfahren wird eingesetzt, um numerisch konzentrieren Mikroskopbilder, und eine einfache Heuristik Bildgebung auf der Grundlage der Gouy-Phase Anomalie wird verwendet, um zu identifizieren Streuobjekten im rekonstruierten Volumen. Diese einfache, aber robuste Methode ergibt sich eine eindeutige, Modell freie Messung der Lage und Form von Objekten in mikroskopischen Proben.

Um die Funktionen des Dihm zu demonstrieren, wurden Versuche an einer Kette von Streptococcus-Bakterien durchgeführt. Die Kette selbst gemessen 10,5 mm lang und wurde von 6-7 sphärozylindrische Zellen (zwei der Zellen in der Kette sind in der Nähe Division) mit Durchmessern im Bereich von 0,6 bis 1 um zusammen. 1a und 1b die wichtigste Schnittstelle zeigen des Wiederaufbaus und der Rendering-Software. Beispiele der numerischen Refokussierung Verfahrens sind in Fig. 2...

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Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Die dreidimensionalen Positionen der schwach streuende Objekte eindeutig mit digitalen Inline holografische Mikroskopie (Dihm), die eine geringfügige Modifikation an einem Standardmikroskop umfasst identifiziert werden. Unsere Software verwendet eine einfache Heuristik Bildgebung verbunden mit Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation, um die dreidimensionale Position und Geometrie eines mikroskopischen Phasenobjekt zu erhalten.

Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) von Schwach-Streuung Themen

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

digital-inline-holographic-microscopy-dihm-weakly-scattering

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.2K Aufrufe.  Harvard University.  Die dreidimensionalen Positionen der schwach streuende Objekte eindeutig mit digitalen Inline holografische Mikroskopie (Dihm), die eine geringfügige Modifikation an einem Standardmikroskop umfasst identifiziert werden. Unsere Software verwendet eine einfache Heuristik Bildgebung verbunden mit Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation, um die dreidimensionale Position und Geometrie eines mikroskopischen Phasenobjekt zu erhalten. 

Serie: Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

Ohne Linsen auskommt, Fluoreszenz-Mikroskopie auf einem Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Forschung

Biotechnik

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope for MEMS Inspection and Characterization

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and automotive. However, effective inspection and characterization metrology systems are needed to ensure the functional reliability of MEMS. This study presents a system based on digital holography as a tool for MEMS metrology. Digital holography has gained increasing attention in the past 20 years. With the fast development and decreasing cost of sensor arrays, resolution of such systems has increased broadening potential applications. Thus, it has attracted attention from both research and industry sides as a potential reliable tool for industrial metrology. Indeed, by recording the interference pattern between an object beam (which contains sample height information) and a reference beam on a CCD camera, one can retrieve the quantitative phase information of an object. However, most of digital holographic systems are bulky and thus not easy to implement on industry production lines. The novelty of the system presented is that it is lens-less and thus very compact. In this study, it is shown that the Compact Digital Holographic Microscope (CDHM) can be used to evaluate several characteristics typically consider as criteria in MEMS inspections. The surface profiles of MEMS in both static and dynamic conditions are presented. Comparison with AFM is investigated to validate the accuracy of the CDHM.

We present a compact reflection digital holographic system (CDHM) for inspection and characterization of MEMS devices. A lens-less design using a diverging input wave providing natural geometrical magnification is demonstrated. Both static and dynamic studies are presented.

Compact-Objektiv lose digitale holografische Mikroskop für MEMS-Inspektion und Charakterisierung

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and ...

Ingenieurwesen

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Optische Mikroskopie: Messung der Cellular biophysikalische Eigenschaften mit einem Standard Optisches Mikroskop

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and nanotechnology. Although near-field scanning microscopy and superlenses have improved the resolution in the near-field region, far-field imaging in real-time remains a significant challenge. Recently, the hyperlens, which magnifies and converts evanescent waves into propagating waves, has emerged as a novel approach to far-field imaging. Here, we report the fabrication of a spherical hyperlens composed of alternating silver (Ag) and titanium oxide (TiO2) thin layers. Unlike a conventional cylindrical hyperlens, the spherical hyperlens allows for two-dimensional magnification. Thus, incorporation into conventional microscopy is straightforward. A new optical system integrated with the hyperlens is proposed, allowing for a sub-wavelength image to be obtained in the far-field region in real time. In this study, the fabrication and imaging setup methods are explained in detail. This work also describes the accessibility and possibility of the hyperlens, as well as practical applications of real-time imaging in living cells, which can lead to a revolution in biology and nanotechnology.

The use of a hyperlens has been regarded as a novel super-resolution imaging technique due to its advantages in real-time imaging and its simple implementation with conventional optics. Here, we present a protocol describing the fabrication and imaging applications of a spherical hyperlens.

Demonstration eines Hyperlens integriert Mikroskop und super-Resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Immunologie und Infektion

Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living cells. The proposed instrument extends the sensitivity of label-free optical microscopy to nanoscale changes in organelle size and shape and can be used to accelerate the study of the structure-function relationship pertaining to organelle dynamics underlying fundamental biological processes, such as programmed cell death or cellular differentiation. The microscope can be easily implemented on existing microscopy platforms, and can therefore be disseminated to individual laboratories, where scientists can implement and use the proposed methods with unrestricted access.
The proposed technique is able to characterize subcellular structure by observing the cell through two-dimensional optical Gabor filters. These filters can be tuned to sense with nanoscale (10's of nm) sensitivity, specific morphological attributes pertaining to the size and orientation of non-spherical subcellular organelles. While based on contrast generated by elastic scattering, the technique does not rely on a detailed inverse scattering model or on Mie theory to extract morphometric measurements. This technique is therefore applicable to non-spherical organelles for which a precise theoretical scatter description is not easily given, and provides distinctive morphometric parameters that can be obtained within unstained living cells to assess their function. The technique is advantageous compared with digital image processing in that it operates directly on the object's field transform rather than the discretized object's intensity. It does not rely on high image sampling rates and can therefore be used to rapidly screen morphological activity within hundreds of cells at a time, thus greatly facilitating the study of organelle structure beyond individual organelle segmentation and reconstruction by fluorescence confocal microscopy of highly magnified digital images of limited fields of view.
In this demonstration we show data from a marine diatom to illustrate the methodology. We also show preliminary data collected from living cells to give an idea of how the method may be applied in a relevant biological context.

We demonstrate a dark-field microscopy method based on Gabor-like filtering to measure subcellular dynamics within single living cells. The technique is sensitive to alterations in the structure of organelles, such as mitochondrial fragmentation.

Optical Microscopy Scatter auf zweidimensionalen Gabor-Filtern

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living ...

Biologie

Uncovering Hidden Dynamics of Natural Photonic Structures Using Holographic Imaging

In this method, the potential of optics and holography to uncover hidden details of a natural system's dynamical response at the nanoscale is exploited. In the first part, the optical and holographic studies of natural photonic structures are presented as well as conditions for the appearance of the photophoretic effect, namely, the displacement or deformation of a nanostructure due to a light-induced thermal gradient, at the nanoscale. This effect is revealed by real-time digital holographic interferometry monitoring the deformation of scales covering the wings of insects induced by temperature. The link between geometry and nanocorrugation that leads to the emergence of the photophoretic effect is experimentally demonstrated and confirmed. In the second part, it is shown how holography can be potentially used to uncover hidden details in the chemical system with nonlinear dynamics, such as the phase transition phenomenon that occurs in complex oscillatory Briggs-Rauscher (BR) reaction. The presented potential of holography at the nanoscale could open enormous possibilities for controlling and molding the photophoretic effect and pattern formation for various applications such as particle trapping and levitation, including the movement of unburnt hydrocarbons in the atmosphere and separation of different aerosols, decomposition of microplastics and fractionation of particles in general, and assessment of temperature and thermal conductivity of micron-size fuel particles.

The paper is primarily focused on the combined power of optical (linear and nonlinear) and holographic methods used to reveal phenomena at the nanoscale. The results obtained from the biophotonic and oscillatory chemical reactions' studies are given as representative examples, highlighting holography's ability to reveal dynamics at a nanoscale.

Aufdecken verborgener Dynamiken natürlicher photonischer Strukturen mit holographischer Bildgebung

In this method, the potential of optics and holography to uncover hidden details of a natural system's dynamical response at the nanoscale is exploited. ...

Chemie

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

Quantifizierung von Mikroorganismen in geringen Konzentrationen mit Hilfe digitalen holographischen Mikroskopie (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Eine Anleitung zu einem stark geneigten bauen fegte Fliese Mikroskop für erweiterte Sichtfeld der Einzelmolekül-Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.