Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri dei laboratori del dottor Barletta e il Dott. Powers per gli utili commenti durante lo sviluppo del protocollo. Ringraziamo Wendy Austin per le discussioni utili e correzione di bozze del manoscritto. Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato finanziato da borse di studio pilota di semi per ogni investigatore di cui sopra presso la University of Nebraska-Lincoln Center Biologia Redox (genitore sovvenzione # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI). Inoltre, ringraziamo il Dr. Ofelia Chacon per fornire fondi da lei R21 sovvenzioni (1R21AI087561-01A1) per le forniture di ricerca e di sostegno stipendio parziale signor Halouska di standardizzare le tecniche NMR riportati nella presente pubblicazione.

1. Protocollo di testo Questo protocollo mette in evidenza l&#39;adattamento della metodologia NMR a M. tubercolosi (Classe III agente). Pertanto, le pratiche di biosicurezza di livello 3 (BSL3) devono essere seguite per lo svolgimento di M. ricerca tubercolosi in un laboratorio certificato annualmente. L&#39;esposizione al laboratorio generati aerosol è il pericolo più importante incontrato da personale che lavora con questi microrganismi. Le seguenti procedure si svolgono nel nostro istituto e possono variare in base alle raccomandazioni del Comitato Istituzionale biosicurezza. Personale comuni dispositivi di protezione consiste in un abito Tyvek, tappo bouffant, stivaletti, respiratore N95, protezione per gli occhi, maniche, e una doppia coppia di guanti in nitrile. Lavori comportanti M. culture tubercolosi e / o manipolazioni con aperto M. tubercolosi contenitori avviene nel tipo A2 o B2 cappa di sicurezza biologica. Plastica ricoperto di carta assorbente è posto sul wavorare superficie. Tutti i materiali / forniture da smaltire o rimuovere l&#39;impianto deve essere posto in due sacchi a rischio biologico e decontaminati in autoclave. Le superfici di lavoro e le attrezzature utilizzate all&#39;interno del cabinet (FastPrep-24 lisi omogeneizzatore, spettrofotometro, secchiello con ghiaccio, ecc) devono essere disinfettati dopo ogni sessione di lavoro con 1% Amphyl (tubercolicida, agente battericida, fungicida, virucida e). M. culture tubercolosi deve essere sottoposto a doppio contenimento per il trasporto di grandi attrezzature che si trovano al di fuori della cappa di sicurezza biologica, come congelatori, incubatori, centrifughe, e frigorifero. La centrifugazione è condotta con coppe di sicurezza chiusi e O-ring tubi con tappo a vite. Per ulteriori analisi fuori del laboratorio BSL3, estratti acellulari sono filtrati attraverso un filtro di 0,2 pm o microrganismi uccisi calore a 95 ° C per 15 min. Due campioni vengono piastrate per verificare l&#39;assenza di unità formanti colonie prima di rimuoverla dal contenimento. <ol><li> Trasferire 110 ml di mezzi completi Middlebrook 7H9 contenente polisorbato 80 (Tween 80 per evitare grumi) brodo (mADC-TW) o di un mezzo adatto a una beuta da 250 ml. Colture in triplicato sono regolarmente coltivati ​​a condizione quando si utilizza 13 C-metaboliti, e dieci culture identiche sono coltivate per 1D 1 profili H NMR. Per due condizioni (ad esempio, con e senza aggiunta di farmaci), volume doppio di cultura per replica possono essere coltivate e diviso in due culture identiche. Tutte le ricette reagenti e soluzioni sono forniti alla fine del protocollo. </li><li> Inoculare brodo con 0,150 ml di M. tubercolosi stock in glicerolo 50% (permette di scongelare il ghiaccio). Vedere la nota 1 di seguito. </li><li> Lasciate crescere la coltura a 37 ° C agitando a 100 rpm per circa 6 giorni (OD 600 0,6-0,8). Vedere la nota 2 di seguito. </li><li> Se non antibiotici, aggiunte alternativi o altri trattamenti sono necessari, le culture sono pronte per essere raccolte. Se i trattamenti vengono utilizzati, continuaredirettamente al punto 5. Rimuovere da 0,5 ml di campione da ciascuna beuta, trasferire in una provetta e posto a 4 ° C per la titolazione di cultura e di controllo della qualità: test di contaminazione, analisi fenotipica, test PCR. Vedere la nota 3. A questo punto, passare al punto 6. </li><li> Rimuovere staffe da shaker ed eseguire il trattamento desiderato (ad esempio, aggiungere farmaco o metabolita). Luogo boccette indietro nello shaker e incubare per un ulteriore periodo (ad esempio, 6-18 ore). Alla fine di questo tempo, prendere un&#39;altra aliquota 1,0 ml e determinare OD 600. Rimuovere da 0,5 ml di campione da ciascuna beuta, trasferire in una provetta e posto a 4 ° C per la titolazione di cultura e di controllo della qualità. </li><li> Luogo culture in ghiaccio per 5 min. Dopo questo passo, lasciare cellule in ghiaccio durante l&#39;intero protocollo rimanente. Culture Harvest mediante centrifugazione a 2.000 xg e 4 ° C per 15 minuti in provette da 50 ml con una centrifuga da banco. Ogni cultura richiede quattro provette con 25 ml ciascuno (per un totale di 100 ml è necessaria per ottenere un adeguato rapporto segnale-rumore per 2D 1 H-13 C esperimenti NMR, in cui è richiesto solo 50 ml per la cultura per 1D 1 H esperimenti NMR). </li><li> Lavare ciascun pellet cellulare due volte con ghiacciata DDH 2 O (circa 15 ml la prima volta e 10 ml la seconda volta) dai parametri di centrifugazione sopra descritti. Per il secondo lavaggio, combinare le aliquote da 10 ml nel tubo stesso prima della filatura. Risospendere il pellet di cellule in un volume finale di 1,0 ml DDH 2 O (necessario regolare il volume di pellet). Se una sospensione singola cella libera di aggregazione è desiderato in questa fase, le cellule possono essere brevemente sonicata e / o passare attraverso un ago calibro 27 per tre volte. In alternativa, il pellet cellulare può essere congelato a -80 ° C e conservato fino al procedimento successivo. In quest&#39;ultimo caso, pellet congelati vengono scongelati in ghiaccio prima risospensione. Risospendere il pellet di cellule in un volume finale di 1,0 ml DDH 2 O come sopra indicato. </li><li> Transfer la cella di 1,0 ml di sospensione in una provetta con tappo a vite contenente 2,0 ml lisi Matrix B (0,1 sfere di silice mm). Posizionare l&#39;omogeneizzatore FastPrep-24 lisi all&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza. Mettere i campioni nel portacampioni, garantire il mantenimento parlato sulla piastra superiore del tubo. Elaborare i campioni per 60 sec in omogeneizzatore ad una impostazione velocità di 6 metri / sec. </li><li> Centrifugare i campioni in una microcentrifuga a 15.000 xg e 4 ° C per 10 min a pellet cellulare detriti e cellule intatte. </li><li> Rimuovere campione surnatante e passa attraverso un filtro siringa (0,2 micron) in una provetta sterile. Piastra 0,1 ml di campione (o una frazione rappresentativa del campione, come per esempio 10%) su agar MADC per verificare che non vi siano cellule vitali. Investigatori possono anche effettuare più di una fase di filtrazione e / o verificare la presenza di cellule vitali negli estratti usando live-morti procedure di colorazione in modo da prevenire o individuare eventuali problemi potenziali biosicurezza. Congelarli in un etanolo-bagno di ghiaccio secco per memorizzarea -80 ° C fino a quando non sono pronti per essere liofilizzate e trasformati in un impianto NMR. </li><li> Dopo 2 mesi, controllare le piastre per verificare l&#39;assenza di unità formanti colonia. Se non CFU sono trovati, possono essere prelevati campioni di laboratorio BSL3. Ulteriori analisi viene effettuata in una struttura NMR standard, che normalmente serve multiutente e opera in nessun esigenze specifiche di contenimento. </li><li> Liofilizzare i campioni a secchezza, quindi risospendere in 0,7 ml di tampone NMR e trasferimento in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare per 3 min a 13000 x g. Rimuovere 0,6 ml e trasferimento in un tubo NMR 5 mm. In alternativa, i campioni liofilizzati possono essere inviati a un impianto esterno di campioni regolari non a rischio biologico. </li><li> NMR dati vengono raccolti immediatamente. Nonostante tutte le precauzioni, enzimi attivi può essere ancora presente e il campione non è tipicamente stabile per lunghi periodi di tempo. Cambiamenti nello spettro NMR è evidente quando i campioni vengono lasciate a temperatura ambiente oppure a 4 ° C per mminerale di 1 settimana. Inoltre, la raccolta dei dati NMR si alterna tra le colture trattate e non trattate di droga, in cui i campioni sono scelti a caso per ogni categoria. Questo impedisce di polarizzazione necessario perché una determinata categoria ha avuto un ritardo più lungo prima gli spettri NMR sono stati raccolti. Una polarizzazione nei dati avverrebbe se gli spettri NMR per tutti i campioni non trattati sono stati raccolti prima, e poi seguito dai campioni di farmaci trattati. Se i campioni non possono essere immediatamente analizzati mediante NMR, i campioni devono essere conservati in 1 ml provette Eppendorf a -80 ° C. </li><li> Dopo aver inserito i campioni in un BACS-120 di campioni, la calibrazione degli strumenti, che coinvolge pochi passi di routine come la serratura, spessore, mettere a punto e ottimizzazione del 90 ° lunghezza di impulso, è necessaria per massimizzare la qualità dei risultati. Un solo campione viene utilizzato per calibrare il 90 ° lunghezza dell&#39;impulso e accordare lo strumento per i campioni rimanenti. Di bloccaggio, spessoramento, e la raccolta di dati NMR per ogni campione è automatizzato using ICONNMR e gradshim. </li><li> A 1D 1 H NMR vengono raccolti utilizzando il Bruker zgesgp sequenza di impulsi con soppressione dell&#39;acqua utilizzando scultura di eccitazione. Un totale di 32k punti di dati con una larghezza di spazzata 5482.5Hz, 128 scansioni e 16 scansioni fittizie sono utilizzati. Un 2D 1 H-13 C spettro HSQC vengono raccolti utilizzando il Bruker hsqcetgp sequenza di impulsi. Un totale di 2048 punti dati con una larghezza di scansione di 5000,0 Hz viene raccolto lungo la diretta 1 dimensione H, e 64 punti di dati con una larghezza di scansione di 18864,9 Hz lungo la dimensione indiretta 13 C. Lo spettro viene raccolto con 128 scansioni e 16 scansioni fittizie per ottenere buon segnale al rumore. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig1.jpg" /> Figura 1. Un diagramma di flusso delle procedure sperimentali è raffigurato. NMR del buffer Soluzione madre di 50 appassionato mM fosfato di potassioer con 50 TMSP pM: <ul><li> 2.17 g K 2 HPO 4 (potassio fosfato bibasico) </li><li> 1,70 g KH 2 PO 4 (potassio fosfato monobasico) </li><li> 7,86 mg di sodio-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D, 98%)) </li><li> Sciogliere in 500 ml di &quot;100%&quot; D 2 O </li><li> La soluzione finale è a pH 7,2 (non corretta) </li></ul> MADC-TW o MOADC-TW (1 L) <ul><li> 4,7 g di brodo Middlebrook 7H9 di base </li><li> 900 ml DDH 2 O </li><li> 2 ml glicerolo </li><li> Miscelare i componenti e autoclave per 25 min. Liquido freddo al tatto e aggiungere le seguenti soluzioni: </li><li> 100 ml ADC durante la preparazione mADC o 100 ml per la preparazione OADC MOADC </li><li> 2,5 ml 20% Tween 80 (in alternativa, 1 ml di non metabolizzabile tyloxapol 20%) </li><li> 10 ml cicloeximide 1% </li></ul> ADC (1 L) <ul><li> 20 g di D (+)-Glucosio </li><li> 50 g BSA FrazioneV </li><li> 8,5 g NaCl </li><li> 800 ml DDH 2 O </li><li> Sciogliere insieme, regolare il volume a 1 L e sterilizzare con 0,2 micron filtro. Conservare a 4 ° C. </li></ul> In alternativa, per preparare OADC (1L), aggiungere tutti i componenti sopra elencati più 50 ml di acido oleico 1% (ricetta sotto fa un lotto 250 ml). Sciogliere insieme, regolare il volume a 1 L e sterilizzare con 0,2 micron filtro. Bottiglia ha bisogno di essere avvolti in un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C. <ul><li> 2,5 g Acido oleico </li><li> 250 ml di NaOH 0,2 M </li><li> Thaw acido oleico (solidifica sulla refrigerazione) mediante riscaldamento a 55 ° C per 10 min e aggiungere soluzione di NaOH e calore con agitazione per 60 min. Conservare in bottiglie di vetro sterili che vengono avvolti in fogli di alluminio. Sigillare con parafilm bottiglie e conservare a 4 ° C. </li></ul> Se si preferisce, è possibile acquistare commerciale BD BBL Middlebrook ADC o OADC con arricchimento catalasi. 1% cicloeximide (100ml) </strong&gt; <ul><li> 1 g cicloeximide </li><li> 100 ml DDH 2 O </li></ul> Sciogliere e sterilizzare con 0,2 micron filtro. Conservare a 4 ° C. Attenzione: cicloeximide è tossica quindi maneggiare con estrema cura. 20% (v / v) Tween 80 (100ml) <ul><li> 20 ml di Tween 80 </li><li> 80 ml ​​DDH 2 O </li></ul> In alternativa, pesano 20 g di Tween 80 (circa 18,9 ml; densità 1,06 g / ml), per preparare 20% w / v soluzione. Calore soluzione a 55 ° C per 30 minuti per sciogliere e miscelare completamente. Sterilizzare liquido con un 0,2 micron filtro. Conservare la soluzione finale a temperatura ambiente. 20% (v / v) tyloxapol (100ml) <ul><li> 20 ml tyloxapol </li><li> 80 ml ​​DDH 2 O </li></ul> In alternativa, pesano 20 g di tyloxapol (circa 18,2 ml; densità 1,1 g / ml), per preparare 20% w / v soluzione. Calore soluzione a 55 ° C per 30 min a dissolve, e mescolare completamente. Sterilizzare liquido con un 0,2 micron filtro. Conservare la soluzione finale a temperatura ambiente. Nota 1: le scorte della glicerina della M. tuberculosis vengono preparati utilizzando il seguente protocollo. Calza di M. tubercolosi <ul><li> Grow M. tubercolosi in 50 ml MADC a saturazione (OD 600 = 1,5 a 2,0) a 37 ° C in condizioni di agitazione (100 rpm). A seconda del ceppo, questo i 7-14 giorni. </li><li> Spin campioni a 2.000 xg a 4 ° C per 15 minuti alla cultura pellet. Rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere in 6 ml di glicerolo 50% sterile. </li><li> Distribuire 1.5 ml in 4 Corning fiale criogeniche ed etichetta in modo appropriato. </li><li> Immediatamente fiale freeze flash in etanolo / bagno di ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. </li></ul> Nota 2: inoculo ceppo H37Rv (-80 ° C disponibile fino a 1,5 anni) in 70 ml di mADC supporto produce un OD 600 &lt;/&gt; Sub di circa 0,6 dopo 5 giorni di crescita a 37 ° C in condizioni di agitazione (100 rpm) a un Innova 40 Shaker. Nota 3: Per verificare la contaminazione della cultura, gli investigatori potrebbero inoculare un&#39;aliquota di cultura su guida standard medi ricchi e verificare l&#39;assenza di crescita dopo incubazione per una notte. Di routine, le colture vengono piastrate su agar mADC per osservare la morfologia delle colonie ed esaminare in contrasto di fase microscopio. Se lo si desidera, le culture può essere verificata mediante PCR utilizzando primers IS 6110 come descritto 3. 2. Risultati rappresentativi Un campione che è ben preparato produrrà uno spettro NMR simile a quello illustrato nella figura 2. Questo spettro è una rappresentazione del M. tubercolosi di tipo selvatico piscina metabolica. I metaboliti identificati sono direttamente o indirettamente associato al D-alanina pathway. Inoltre, la grandezza di intensità di picco è proporzionale alla concentrazione dei metaboliti presentarenell&#39;estratto cella. Pertanto i cambiamenti di intensità di picco tra le culture non trattate, trattamento farmacologico, e ceppi mutanti può indicare perturbazioni in metaboliti e vie metaboliche. Il M. tuberculosis 1D 1 H NMR sono stati raccolti su un Bruker Avance 500 MHz spettrometro dotato tripla risonanza, asse Z cryoprobe gradiente. Lo spettro contiene ca. 400 cime, da cui è stato possibile identificare e quantificare 40-50 metaboliti, tra cui aminoacidi, precursori di nucleotidi, e intermedi e acido citrico e glicolitici. Un commutatore di BACS-120 campione con il software Bruker Icon è stato utilizzato per automatizzare la raccolta dei dati NMR. 1D 1 H NMR sono stati raccolti usando scolpire eccitazione 4 per rimuovere efficacemente il solvente e mantenere una linea di base piatta, eliminando la necessità di raccolta basale che possono indurre artefatti nella successiva analisi delle componenti principali (PCA) o ortogonali almeno parziale analisi discriminante quadrati (OPLS- DA). A 1D 1 H NMR sono raccolte a 25 ° C con una larghezza di spettro 5482,5 Hz e 32K punti dati. Un totale di 16 scansioni dummy e 128 scansioni sono state utilizzate per ottenere lo spettro. La 1D ACD Labs NMR software del processore è stato utilizzato per semi-automatico elaborare tutte le 1D 1 H NMR. Gli spettri sono stati trasformata di Fourier, graduale, e fa riferimento al picco TMSP (0,0 ppm). Il pacchetto software NMRpipe stato utilizzato per elaborare singolarmente il 2D 1 H-13 C NMR e analizzati con NMRDraw. Il Bruker FID file di dati era stato convertito in un formato di file riconoscibile da NMRpipe e lo spettro è stata trasformata di Fourier, correzione di fase, e zero riempito. I picchi NMR osservati nel 1D 1 H NMR 2D e 1 H-13 C NMR sono assegnate a specifici metaboliti mediante 1 H e 13 C Tolleranze di chemical shift di 0,05 e 0,50 ppm, rispettivamente, e il Madison Metabolomica Consorzio Database (MMCD ), <sup&gt; 5 la BioMagResBank, 6 e il database umano metaboloma. 7 In particolare, gli spettri NMR 1D e 2D sono raccolte manualmente picco, dove la lista picco di NMR chemical shift viene poi caricato nel database umano metaboloma. I metaboliti identificati dal Database metaboloma umano sono assegnati allo spettro NMR basato sia massimizzare il numero delle corrispondenti risonanze NMR e appartenente ad una rete metabolica. Ogni composto o metabolita di solito ha più coppie CH e risonanze NMR corrispondentemente più. Così, più di queste risonanze NMR che si osservano nello spettro NMR sperimentale, più è probabile il metabolita è presente. Analogamente, identificando metaboliti multipli associati con lo stesso percorso aumenta la probabilità di assegnazioni corrette. La presenza di metaboliti e vie metaboliche sono verificati con l&#39;Enciclopedia di Kyoto dei geni e genomi (KEGG) 8 ei database MetaCyc 9. Mycobacterium smegmATIS è un sistema modello utile per M. tubercolosi e altri patogeni micobatteriche. Come descritto altrove, campioni di M. smegmatis potrebbe anche essere interrotto da sonicazione 10. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig2.jpg" /> Figura 2. 1D 1 H NMR del estratto cellulare Mycobacterium tuberculosis. Picchi NMR associati metaboliti rappresentativi sono etichettati. Abbreviazioni sono le seguenti: AMP, adenosina fosfato mono; α-Kg, α-chetoglutarato, Glu, glutammato e Ala, alanina.

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis.">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates.">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function:+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase.">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li><li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection.">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis.">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li><li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1.">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria:+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system.">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li><li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+(LC-MS)+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery.">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li><li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy:+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox.">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li><li>Simpson, R. J., Inglis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).</li><li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis.">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li><li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis:+an+unexpected+frontier.">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li><li>Who. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Organization.">Health Organization.</a> Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).</li><li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensively+drug-resistant+tuberculosis.">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un numero significativo di studi ha analizzato i profili di trascrittomica e proteomica di M. tubercolosi sotto una varietà di in vitro e in vivo. 11-16 definitiva, cambiamenti nell&#39;espressione genica e dell&#39;attività enzimatica portare a variazioni nella concentrazione di piccole molecole di peso molecolare. La descrizione completa di questi composti costituisce il metaboloma. Pertanto, gli effetti delle droghe e delle condizioni di crescita variabile sulle vie metaboliche...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> ADC Arricchimento </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 Sample Changer </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bruker Avance NMR </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> Frazione V </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td><td> Da banco </td></tr><tr><td> Tubi per centrifuga </td><td> Corning </td><td> 430291 </td><td> 50 ml polipropilene sterile </td></tr><tr><td> Fiale criogeniche </td><td> Corning </td><td> 430488 </td><td> 2,0 ml in polipropilene sterile </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG scientifico </td><td> C-1189 </td><td> Tossico </td></tr><tr><td> D (+) - Glucosio </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Ossido di deuterio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Beuta </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> Sterile, base piatta, policarbonato, 0,22 micron membrana in PTFE tappo ventilato </td></tr><tr><td> Flash Freeze Flask </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ml </td></tr><tr><td> Liofilizzatore </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4.5 L da banco </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatrice </td><td> Nuovo Brunswick </td><td> Innova 40 </td><td> Agitatore da banco </td></tr><tr><td> Lisi Matrix B </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> Lysis macchina </td><td> MP Biomedicals </td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Da banco </td></tr><tr><td> Microcentrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microcentrifuga 22R </td><td> Da banco </td></tr><tr><td> Brodo Middlebrook 7H9 </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR tubi </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Arricchimento OADC </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> Acido oleico </td><td> Sigma </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di potassio bibasico </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor - Microcentrifugare 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> Sigillata e polipropilene </td></tr><tr><td> Rotor - Allegra X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> Con bio-certificati coperture </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> Cambridge Isotope </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> Spettrofotometro </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Spettrofotometro Cuvette </td><td> Sagola di salvataggio </td><td> LS-2410 </td><td> 1,5 ml in polistirolo, 2 lati trasparenti </td></tr><tr><td> Siringa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td> Sterile, 3 ml Luer-Lok </td></tr><tr><td> Siringa Filtro </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> Acetato di 0,2 micron di cellulosa sterile </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation of mycobacterium tuberculosis extracts for nuclear magnetic resonance metabolomic studies

Mycobacterium tuberculosis è una delle principali cause di mortalità degli esseri umani su scala globale. L&#39;emergere di due multi-(MDR) e estesamente-(XDR) ceppi farmaco-resistenti minaccia di far deragliare attuali sforzi di lotta contro la malattia. Pertanto, vi è una necessità urgente di sviluppare farmaci e vaccini che sono più efficaci di quelle attualmente disponibili. Il genoma di M. la tubercolosi è nota da più di 10 anni, ma ci sono importanti lacune nella nostra conoscenza della funzione genica e essenzialità. Molti studi hanno utilizzato da analisi di espressione genica sia a livello trascrittomica e proteomica per determinare gli effetti dei farmaci, ossidanti, e le condizioni di crescita sui modelli globali di espressione genica. In definitiva, la risposta finale di questi cambiamenti si riflette nella composizione metabolico del batterio comprendere alcune migliaia di sostanze a basso peso molecolare. Confrontando i profili metabolici di tipo selvatico e mutanti, sia trattata o treated con un particolare farmaco, può effettivamente permettere l&#39;identificazione di destinazione e può portare allo sviluppo di nuovi inibitori con attività anti-tubercolare. Analogamente, gli effetti di due o più condizioni del metaboloma può anche essere valutato. Risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnologia potente che viene utilizzato per identificare e quantificare intermedi metabolici. In questo protocollo, le procedure per la preparazione di M. tubercolosi estratti cellulari per l&#39;analisi NMR metabolomica sono descritti. Colture di cellule vengono coltivate in condizioni appropriate e richiesto livello di biosicurezza 3 di contenimento 1, raccolte e sottoposte a lisi meccanica pur mantenendo basse temperature per massimizzare la conservazione dei metaboliti. Lisati cellulari sono recuperati, filtrati sterilizzato, e conservati a temperature bassissime. Aliquote di questi estratti di cellule sono piastrate su agar Middlebrook 7H9 per unità formanti colonia per verificare l&#39;assenza di cellule vitali. Su due mesi di incubazione a 37 ° C, se non vicolonie capaci si osservano, i campioni vengono rimossi dalla struttura di contenimento per il trattamento a valle. Sono estratti liofilizzati, risospese in tampone deuterato e iniettato nello strumento NMR, catturando dati spettroscopici che viene poi sottoposto ad analisi statistica. Le procedure descritte possono essere applicate sia unidimensionale (1D) 1 H NMR e bidimensionale (2D) 1 H-13 C NMR. Questa metodologia fornisce più affidabile di identificazione piccolo peso molecolare metabolita e analisi quantitative più affidabili e sensibili di composizioni estratto cellulare metaboliche rispetto ai metodi cromatografici. Variazioni della procedura descritta in seguito alla fase di lisi cellulare può anche essere adattato per parallela analisi proteomica.

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Il profilo metabolico di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; È determinata dopo la crescita in colture in brodo. Le condizioni possono essere variate per testare gli effetti di integratori alimentari, ossidanti e anti-tubercolosi agenti sul profilo metabolico di questo microrganismo. Procedura per la preparazione estratto è applicabile sia per 1D<sup&gt; 1</sup&gt; H e 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C NMR.

Preparazione del campione di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Principles of Nuclear Magnetic Resonance

SCIENTISTS IN ACTION

15.3K Views.  University of Nebraska-Lincoln. Il profilo metabolico di Mycobacterium tuberculosis È determinata dopo la crescita in colture in brodo. Le condizioni possono essere variate per testare gli effetti di integratori alimentari, ossidanti e anti-tubercolosi agenti sul profilo metabolico di questo microrganismo. Procedura per la preparazione estratto è applicabile sia per 1D 1 H e 2D 1 H- 13 C NMR.

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A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Trascrizioni specifici da formalina paraffina fisso incorporato Lung granulomi

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Pure Shift Nuclear Magnetic Resonance: a New Tool for Plant Metabolomics

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the most powerful tools used in metabolomics. It stands as a highly accurate and reproducible method that not only provides quantitative data but also permits structural identification of the metabolites present in complex mixtures.
Metabolic profiling by 1H NMR has proven useful in the study of various types of plant scenarios, which include the evaluation of crop&#160;conditions, harvest and post- harvest treatments, metabolic phenotyping, metabolic pathways, gene regulation, identification of biomarkers, chemotaxonomy, quality control, denomination of origin, among others. However, signal overlapping of the large number of resonances with expanded J-coupling multiplicities complicates the spectra analysis and its interpretation, and represents a limitation for classical 1H NMR profiling.
In the last decade, novel NMR broadband homonuclear decoupling techniques through which multiplet signals collapse into single resonance lines - commonly called Pure Shift methods - have been developed to overcome the spectra resolution problem inherent to 1H NMR classical spectra.
Here a step-by-step protocol of the plant extract preparation and the procedure to record optimal Pure Shift PSYCHE and SAPPHIRE-PSYCHE spectra in three different plant matrices - Vanilla plant&#160;leaves, potato tubers (S. tuberosum), and Cape gooseberries (P. peruviana) - is presented. The effect of the gain in resolution in metabolic identification, correlation analysis and multivariate analyses, as compared against classical spectra, is discussed.

<meta charset="utf8"></head><body>Risonanza magnetica nucleare Pure Shift: un nuovo strumento per la metabolomica delle piante

This paper presents the use of PSYCHE and SAPPHIRE-PSYCHE in the metabolic profiling of plants and includes detailed procedures for sample preparation and optimal Pure Shift NMR spectra recording. Examples through which the gain in resolution achieved by homonuclear decoupling allows a more comprehensive understanding of the system are discussed.

Risonanza magnetica nucleare Pure Shift: un nuovo strumento per la metabolomica delle piante

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the most powerful tools used in metabolomics. It stands as a highly accurate and reproducible method that not ...

Biochimica

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

Neuroscienze

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each other at the biochemical level1. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is one of several technologies, including gas chromatography&#x2013;mass spectrometry (GC-MS), with considerable promise for such studies. Advantages of NMR are that it is suitable for untargeted analyses, provides structural information and spectra can be queried in quantitative and statistical manners against recently available databases of individual metabolite spectra2,3. In addition, NMR spectral data can be combined with data from other omics levels (e.g. transcriptomics, genomics) to provide a more comprehensive understanding of the physiological responses of taxa to each other and the environment4,5,6. However, NMR is less sensitive than other metabolomic techniques, making it difficult to apply to natural microbial systems where sample populations can be low-density and metabolite concentrations low compared to metabolites from well-defined and readily extractable sources such as whole tissues, biofluids or cell-cultures. Consequently, the few direct environmental metabolomic studies of microbes performed to date have been limited to culture-based or easily defined high-density ecosystems such as host-symbiont systems, constructed co-cultures or manipulations of the gut environment where stable isotope labeling can be additionally used to enhance NMR signals7,8,9,10,11,12. Methods that facilitate the concentration and collection of environmental metabolites at concentrations suitable for NMR are lacking. Since recent attention has been given to the environmental metabolomics of organisms within the aquatic environment, where much of the energy and material flow is mediated by the planktonic community13,14, we have developed a method for the concentration and extraction of whole-community metabolites from planktonic microbial systems by filtration. Commercially available hydrophilic poly-1,1-difluoroethene (PVDF) filters are specially treated to completely remove extractables, which can otherwise appear as contaminants in subsequent analyses. These treated filters are then used to filter environmental or experimental samples of interest. Filters containing the wet sample material are lyophilized and aqueous-soluble metabolites are extracted directly for conventional NMR spectroscopy using a standardized potassium phosphate extraction buffer2. Data derived from these methods can be analyzed statistically to identify meaningful patterns, or integrated with other omics levels for comprehensive understanding of community and ecosystem function.

A method for metabolite extraction from microbial planktonic communities is presented. Whole community sampling is achieved by filtration onto specially prepared filters. After lyophilization, aqueous-soluble metabolites are extracted. This approach allows for application of environmental metabolomics to trans-omics investigations of natural or experimental microbial communities.

Concentrazione dei metaboliti a bassa densità Comunità planctoniche per Metabolomica ambientali utilizzando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

Biologia

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Un test di tubercolosi a carico batterico molecolare (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well as other phenotypic characteristics. However, they all have in common the most relevant character of mycobacteria: its unique and highly hydrophobic cell wall. Mycobacteria species contain a membrane-covalent linked complex that includes arabinogalactan, peptidoglycan, and long-chains of mycolic acids with types that differ between mycobacteria species. Additionally, mycobacteria can also produce lipids that are located, non-covalently linked, on their cell surfaces, such as phthiocerol dimycocerosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), glycopeptidolipids (GPL), acyltrehaloses (AT), or phosphatidil-inositol mannosides (PIM), among others. Some of them are considered virulence factors in pathogenic mycobacteria, or critical antigenic lipids in host-mycobacteria interaction. For these reasons, there is a significant interest in the study of mycobacterial lipids due to their application in several fields, from understanding their role in the pathogenicity of mycobacteria infections, to a possible implication as immunomodulatory agents for the treatment of infectious diseases and other pathologies such as cancer. Here, a simple approach to extract and analyze the total lipid content and the mycolic acid composition of mycobacteria cells grown in a solid medium using mixtures of organic solvents is presented. Once the lipid extracts are obtained, thin-layer chromatography (TLC) is performed to monitor the extracted compounds. The example experiment is performed with four different mycobacteria: the environmental fast-growing Mycolicibacterium brumae and Mycolicibacterium fortuitum, the attenuated slow-growing Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), and the opportunistic pathogen fast-growing Mycobacterium abscessus, demonstrating that methods shown in the present protocol can be used to a wide range of mycobacteria.

A protocol is presented to extract the total lipid content of the cell wall of a wide range of mycobacteria. Moreover, extraction and analytical protocols of the different types of mycolic acids are shown. A thin-layer chromatographic protocol to monitor these mycobacterial compounds is also provided.

Analisi della composizione lipidica dei micobatteri mediante cromatografia a strato sottile

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. Specifically, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EVs play a role in the host-pathogen interaction and response to environmental stress. Mtb EVs are also highly antigenic and show potential as vaccine components. The most common method for purifying Mtb EVs is density gradient ultracentrifugation. This process has several limitations, including low throughput, low yield, reliance on expensive equipment, technical challenges, and it can negatively impact the resulting preparation. Size exclusion chromatography (SEC) is a gentler alternative method that combats many of the limitations of ultracentrifugation. This protocol demonstrates that SEC is effective for Mtb EV enrichment and produces high-quality Mtb EV preparations of increased yield in a rapid and scalable manner. Additionally, a comparison to density gradient ultracentrifugation by quantification and qualification procedures demonstrates the benefits of SEC. While the evaluation of EV quantity (nanoparticle tracking analysis), phenotype (transmission electron microscopy), and content (Western blotting) is tailored to Mtb EVs, the workflow provided can be applied to other mycobacteria.

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

This protocol describes size exclusion chromatography, a facile and reproducible technique for enriching Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicles from culture supernatants.

Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, including metabolites, lipids, proteins, and nucleic acids, several groups have evaluated either the native or recombinant versions of bEVs for their protective potency as subunit vaccine candidates. Unlike native EVs, recombinant EVs are molecularly engineered to contain one or more immunogens of interest. Over the last decade, different groups have explored diverse approaches for generating recombinant bEVs. However, here, we report the design, construction, and enrichment of recombinant mycobacterial EVs (mEVs) in mycobacteria. Towards that, we use Mycobacterium smegmatis (Msm), an avirulent soil mycobacterium as the model system. We first describe the generation and enrichment of native EVs of Msm. Then, we describe the design and construction of recombinant mEVs that contain either mCherry, a red fluorescent reporter protein, or EsxA (Esat-6), a prominent immunogen of Mycobacterium tuberculosis. We achieve this by separately fusing mCherry and EsxA N-termini with the C-terminus of a small Msm protein Cfp-29. Cfp-29 is one of the few abundantly present proteins of MsmEVs. The protocol to generate and enrich recombinant mEVs from Msm remains identical to the generation and enrichment of native EVs of Msm.

This protocol details the enrichment of native mycobacterial extracellular vesicles (mEVs) from axenic cultures of Mycobacterium smegmatis (Msm) and how mCherry (a red fluorescent reporter)-containing recombinant MsmEVs can be designed and enriched. Lastly, it verifies the novel approach with the enrichment of MsmEVs containing the EsxA protein of Mycobacterium tuberculosis.

Preparazione del campione di

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