Questo saggio batterico molecolare della tubercolosi, risponde a tre domande chiave. Uno:Qual è l'entità del peso della malattia del paziente? Secondo:In che modo l'onere della malattia del paziente risponde al farmaco anti-tubercolosi?
E tre:Qual è la relazione tra l'onere della malattia e la risposta al trattamento? Questo saggio produce un risultato quantitativo del carico di tubercolosi del paziente e misura come questo carico cambia con il trattamento in breve tempo. Con la modifica, questa metodologia può essere applicata ad altri agenti patogeni batterici.
Abbiamo già sviluppato una tecnologia simile per la diagnosi di micobatteri nontubercolari e batteri associati alla broncopneumopatia cronica ostruttiva. Quando esegui questa tecnica per la prima volta, guarda il video e pratica i passaggi. È molto importante esercitarsi con campioni che non sono necessari per i risultati diagnostici dei pazienti.
La dimostrazione visiva è fondamentale perché semplifica l'apprendimento e la padronanza dei passaggi, in particolare le parti del metodo difficili da spiegare nel testo. Iniziare preparando le colture cellulari. Su una panchina da laboratorio pulita o in una cabina di classe uno, raccogliere aliquote di millilitro di fase esponenziale bacille calmette-guerin o cultura BCG in tubi di plastica da 15 millilitri e chiuderli strettamente.
Quando si preparano campioni di espettorato del paziente, lavorare in uno spazio ben ventilato e seguire le linee guida nel manuale GL One Stop TB. Aprire con cura la tazza del campione e pipettare aliquote di un millilitro in tubi di centrifuga in plastica da 15 millilitri. Quindi, chiudere saldamente i tubi.
Trasferire i tubi campione in un rack di attesa immerso in un bagno d'acqua preriscaldato a 95 gradi Celsius, assicurandosi che 3/4 di ogni tubo sia immerso. Far bollire i campioni per 20 minuti. Quindi, trasferire i tubi sul banco per raffreddare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Eseguire l'estrazione dell'RNA in una cappa aspirante se si utilizza un kit con cloroformio fenolo o etanolo capitale tumorale. La procedura di RNA qui illustrata è la procedura di estrazione del cloroformio fenolo. Tuttavia, possono essere utilizzati anche metodi alternativi per l'estrazione dell'RNA.
Trasferire un millilitro aliquote del campione inattivato dal calore in tubi da 1,5 millilitri e picchiare 100 microlitri di controllo dell'estrazione in ciascun campione. Chiudere i tubi e mescolarli invertendo tre volte. Centrifugare i tubi a 20.000 volte g per 10 minuti.
Quindi, aspirare il supernatante, lasciando 50 microlitri di sedimento. Sospendiamo il sedimento in 950 microlitri di tampone di lisi mediante pipettazione e trasferiamo l'intera sospensione nei tubi a matrice di lisciviatura forniti con il kit di estrazione dell'RNA. Chiudere saldamente i tubi e assicurarsi che siano etichettati sia sul coperchio che sul lato.
Quindi, omogeneizzare i campioni per 40 secondi a 6.000 giri/min. Centrifugare il lysate a 12.000 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare tubi freschi da un millilitro e aggiungere 300 microlitri di cloroformio.
Utilizzare una pipetta da un millilitro per aspirare con cura il supernatante senza toccare la matrice di lisciviatura e trasferirla nel tubo con il cloroformio. Vortice i tubi per cinque secondi e lasciarli depositare per cinque minuti o fino a quando tre fasi sono chiaramente visibili. Centrifugare i tubi a 12.000 volte g per cinque minuti.
Quindi, pipettare con cura la fase superiore e trasferirla in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di ghiaccio freddo al 100% di etanolo al campione, chiudere il tubo e invertirlo tre volte per mescolare. Incubare i tubi a meno 80 gradi Celsius per 15 minuti o a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, caricare i tubi in una micro centrifuga e centrifuga pre-refrigerata per 20 minuti a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante, aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo al 70% e centrifuga per altri 10 minuti a 13.000 volte g. Scarta tutto il supernatante.
E incubare i tubi a 50 gradi Celsius per 20 minuti per asciugare il pellet di acido nucleico, assicurandosi di mantenere i tubi parzialmente aperti per consentire l'evaporazione dell'etanolo. Quindi, aggiungere 100 microlitri di acqua priva di nucleo al pellet e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Vortice il campione per tre secondi e procedere con la rimozione del DNA o conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.
Preparato il mix di DNA secondo le direzioni del manoscritto e pipetta 11 microlitri in ogni tubo contenente estratto di RNA. Vortice per tre secondi e girare brevemente verso il basso per rimuovere eventuali goccioline dalla parete del tubo. Quindi, incubare il tubo a 37 gradi Celsius per 30 minuti nel blocco caldo o nell'incubatore.
Dopo l'incubazione, aggiungere un microlitro aggiuntivo dell'unico enzima del DNA direttamente al tubo e mescolare bene con il vortice. Quindi, incubare i tubi per altri 30 minuti a 37 gradi Celsius. Scongelare e vortice il reagente di inattivazione del DNA.
Quindi, aggiungere 10 microlitri a ogni estratto di RNA. E incubare i tubi a temperatura ambiente per cinque minuti. Vortice i tubi tre volte durante la fase di incubazione.
Quindi, centrifugare la miscela a 13.000 volte g per due minuti e trasferire con cura il supernatante sul tubo libero di un RNA da 1,5 millilitri, assicurandosi di non toccare nessuna matrice di inattivazione. Diluire tutti i campioni di RNA sconosciuti uno a 10 nell'acqua libera dell'RNA, quindi mescolarli con vortice per cinque secondi e facendoli girare brevemente verso il basso. Scongelare campioni di MTB ed EC-RNA e effettuare rispettivamente sette e sei diluizioni di dieci volte per una curva standard.
Preparare i mix master RT plus e RT meno PCR in base alle indicazioni del manoscritto. Vortice l'RT più mescolare e trasferire 16 microlitri in ogni tubo RT più PCR. Quindi, vortice il mix RT meno e aggiungere 16 microlitri in ogni tubo RT meno PCR.
Aggiungere quattro microlitri di estratto di RNA o acqua e duplicare ai tubi RT plus. L'acqua è il controllo non modello o NTC. Aggiungere quattro microlitri di estratto di RNA o acqua ai tubi RT meno.
Caricare i tubi di reazione nella macchina PCR in tempo reale, programmare la reazione come descritto nel manoscritto ed eseguire la reazione. Per interpretare la risposta del trattamento, utilizzare la curva standard per convertire i valori del QG in carico batterico e calcolare la risposta come variazione della carica batterica durante il periodo di follow-up del trattamento. Il calo della carica batterica dopo il trattamento significa una risposta positiva mentre nessun cambiamento o aumento della carica batterica implica una risposta negativa.
Per verificare che tutti i bacilli M.tuberculosis fossero inattivati dal calore, è stata misurata la densità ottica delle cellule e confrontata con quella delle cellule vive. Non è stato osservato alcun cambiamento nell'OD nel tempo per i campioni inattivati dal calore che non indicano alcuna crescita. Campioni inattivati dal calore sono stati incubati a 37 gradi Celsius per determinare se l'RNA si degrada a seguito dell'inattivazione termica delle cellule.
Non è stata trovata alcuna differenza tra l'RNA raccolto immediatamente dopo l'inattivazione del calore e l'RNA isolato uno, due, tre e quattro giorni dopo sia nelle colture BCG che nell'espettorato positivo alla tubercolosi. Quando l'enzima A dell'RNA è stato aggiunto esogenamente ai campioni, prima e dopo l'inattivazione del calore, la perdita di RNA si è verificata in tutti i campioni inattivati dal calore durante quattro giorni di incubazione. L'effetto dell'inattivazione termica sull'RNA ribosomiale è stato misurato nelle colture BCG e nell'espettorato da pazienti positivi alla TBC.
La carica batterica misurata della coltura di controllo era superiore alla carica batterica combinata di coltura inattivata dal calore a 80 gradi Celsius, 85 gradi Celsius e 95 gradi Celsius sia per i campioni di BCG che di espettorato. L'inattivazione termica dei campioni causa una perdita minima di RNA, lasciando un RNA adeguato per tb-MBLA a valle e altri test molecolari a valle. La microscopia elettronica a trasmissione è stata utilizzata per studiare se le cellule sono state lese dall'inattivazione del calore.
L'ispezione delle cellule a ingrandimento sempre più basso ha rivelato le pareti cellulari intatte e i corpi lipidici intracellulari visibili. Le cellule apparivano allungate, ma non lese. Quando si tenta questa procedura, è fondamentale ricordare di aggiungere il controllo di estrazione, che controlla eventuali risultati falsi negativi dovuti alla scarsa estrazione dell'RNA.
Questo approccio può essere applicato a batteri associati a malattie polmonari ostruzioniche croniche, infezioni da micobatteri nontubercolari e altri agenti patogeni respiratori. I risultati quantitativi di TB-MBLA hanno permesso la modellazione matematica e farmaco di come i pazienti rispondono a una terapia della tubercolosi. Non vediamo l'ora di applicare la tecnica nelle cure di routine in cui vengono gestiti i pazienti affetti da tubercolosi.
