Ringrazio Watanabe L, M Gorczyca e altri membri del laboratorio Yoshihara per gli utili commenti e discussioni. Ringrazio K. Scott e L. Looger per gli stock finestre, S Yokoyama per dimostrare esperimenti, Shinya Iguchi per assistenza tecnica e Nobuko Yoshihara di materiale informativo. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Mental Health MH85958 Grants, e la Fondazione Worcester a MY

1. Costruire le MOSCHE <ol><li> Forma una piattaforma dal coperchio della piastra da 35 mm Falcon fondendo la parete laterale e intaglio per formare un angolo appropriato e spessore (Figura 1a; Figura 2). Eseguire un foro nella piattaforma di accettare la testa fly (Figura 1a, b), tale che i boccale sono liberamente esposta all&#39;esterno della camera (Figura 1a). Tagliare l&#39;estremità di una punta Pipetman, con la dimensione corrispondente al volo da osservare. Incollare la punta alla piattaforma come mostrato nella Figura 1a per completare le mosche (Figura 2). </li></ol> 2. Preparazione del Fly per l&#39;osservazione <ol><li> Starve uno mosca adulta per 24 ore a 25 ° C prima dell&#39;esperimento ponendolo in un flaconcino con solo un tovagliolo di carta bagnata, fame se è necessario. </li><li> Anestetizzare la mosca ponendolo in un tubo di 15 ml di plastica in piedi sul ghiaccio. </li><li> Con pinze, inserire una mosca nella camera delVOLA, e spingere delicatamente la mosca fino a quando non è in grado di muoversi. Quindi, inserire una spina per mantenere il volo. (Figura 1a, b). </li><li> Sigillare le parti circostanti della prossimali proboscide (rostro) al bordo interno del foro, applicare una piccola quantità di luce La colla (Tetric EvoFlow) ai lati e al di sopra del rostro dall&#39;esterno (frecce in figura 3). Anche applicare la colla dall&#39;interno delle mosche allo spazio tra la parte dorsale della testa e il bordo interno del foro (Figura 1b). Per consentire la tribuna di muoversi liberamente, occorre prestare attenzione per evitare che la colla di toccare il podio utilizzando un ciglio (o qualcosa di simile) per diffondere la colla. Infine, curare la colla con il più debole illuminazione della luce blu sufficienti per la cura per evitare di danneggiare la mosca dal calore eccessivo. Togliere il tappo. </li><li> Un filo di tenere il rostro parzialmente sollevato (freccia in figura 3) possono essere impiegati per stabilizzare la mosca &#39;testa di s evitando urto della parte faringea di SOG e per esporre la parte ventrale del SOG, soprattutto per i terminali di imaging presinaptici di neuroni Gr5a 8, che sono coperti da una parte della faringe quando la proboscide è completamente retratto. </li><li> Riempire la superficie della piattaforma con un senza zucchero contenenti salina (in mM): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4,5, CaCl 2, 1,5, e HEPES-NaOH, 5 con un pH di 7,1 10. Questo saccarosio senza soluzione salina ha tonicità simili a quelli di uso comune contenente saccarosio saline come HL3.1 11. </li><li> Aprire la capsula testa con una lama in tungsteno e pinze con le punte affilate come forbici, che è un dispositivo su misura e originariamente progettato dal Dr. Kageyuki Yamaoka, il Giappone, per tagliare le cuticole e trachea per esporre il SOG (Figura 4). Il bordo ventrale della cuticola testa è stata tagliata come ventrale più possibile, mentre il taglio bordo dorsale non era così critico. In primo luogo, fare un incisione attraverso l&#39;margine posteriore usando una lama di tungsteno. Quindi, tagliare la parte ed i bordi anteriori con le pinze appuntite. Il pezzo cuticola taglio deve essere sollevato con le pinze e rimossi. Nervi Antenne e antenne dovrebbero essere tagliati fuori dalle pinze appuntite. </li><li> Per evitare artefatti movimento durante la registrazione, il cervello deve essere stabilizzate mediante l&#39;asportazione di alcune parti della mosca. In primo luogo, rimuovere selettivamente i sacchi aerei tra la SOG e cuticola. Tagliare il esofago alla fine verso la faringe e alla fine entrare nel SOG rimuovere la connessione tra la faringe e il cervello. Quindi estrarre Muscle 16 12, e, infine, staccare qualsiasi trachea che collega il cervello e la cuticola. </li><li> Abbiamo impostato le nostre mosche sul palcoscenico di un microscopio Olympus BX51WI collegato ad un sistema di rotazione del disco microscopio confocale (Improvision in PerkinElmer) (Figura 5). Una lente immersione in acqua, ad esempio 40X/0.8 NA, è stata immersa nella vasca (figura 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + Imaging of the Brain <ol><li> Ca 2 + immagini utilizzando GCaMP3.0 1, 9 è stata effettuata mediante il metodo stabilito da Marella et al. 8 (Figura 6). Utilizzando un microscopio confocale a disco rotante (Improvision), prendere una singola sezione ottica a 4 Hz con un tempo di esposizione di 122ms con 491nm laser di eccitazione, di messa a fuoco la regione di interesse (un corpo cellulare di un neurone motore, o un interneurone, o terminali presinaptici gustative dei neuroni sensoriali) con software Velocity, ver. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. Stimolare la proboscide <ol><li> Aspirare 100mM soluzione acquosa di saccarosio in un ago ipodermico con uno stoppino piccolo (a base di carta giapponese Washi, vedere tabella di reagenti specifici) sporgente dalla punta (Figura 7). </li><li> Scaricare una piccola goccia di soluzione di saccarosio sul stoppino, quindi, aspirare, immediatamente before applicando il bagnato stoppino di carta Washi alla punta della proboscide. Lo stoppino di carta Washi deve essere applicata solo per un istante per evitare di sazietà (Figura 8). Monitorare la risposta estensione proboscide (PER) comportamento utilizzando una fotocamera CCD collegata ad un microscopio di dissezione (Figura 5) simultaneamente con Ca 2 + imaging. I dati devono essere prese entro un&#39;ora dopo aver iniziato la dissezione perché la risposta PER non viene mantenuta più di un&#39;ora in queste condizioni. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Motoneuroni del goniometro rostro, una coppia di muscoli principali responsabili per il sollevamento del rostro dell&#39;estensione proboscide, sono stati segnalati per mostrare le risposte robusti agli stimoli dolci 13. Figura 9 mostra Ca 2 + segnali attraverso GCaMP3.0 1, 9 espressa da un Gal 4 driver, E49 13, da un corpo cellulare del neurone motore. Come mostrato nel video, uno Robuv è stata osservata in sincronia con un aumento Ca 2 + segnale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del cervello Fly live Imaging ed Elettrofisiologia Stage (aria). uno, le mosche è costruito in modo tale che l&#39;angolo della parete permette la testa mosca uscire dritto. Tre segmenti della proboscide mosca sono color-coded, il podio è il magenta. La mosca viene inserito nella camera con una pinza, e un pezzo tagliato dalla estremità di una punta Pipetman è connessa al retro della camera di bloccare la fuoriuscita mosca. B, il foro è annoiato conforme alla testa della mosca. Le lacune rimanenti vengono sigillati con la colla luce, come indicato per garantire che non vi siano perdite. Dopo che la colla è asciutta, la punta Pipetman come una presa è stata rimossa. Saline viene versato nei MOSCHE tali che la superficie del cervello è completamente coperto. Occorre garantire che non vi siano perdite salinezare successivamente sull&#39;estremità anteriore della testa mosca. L&#39;area ombreggiata circondata dalla linea tratteggiata in pannello b mostra la parte da sezionati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografia delle mosche. La parete a forma di mezzaluna di colla (una pistola da colla) è fatto per controllare il flusso di soluzione salina durante la perfusione, e per ridurre la quantità di soluzione salina utilizzata. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> Figura 3. Vista frontale di una mosca montato le mosche. Questa immagine mostra come una mosca si trova nelle mosche e come la luce-colla viene applicata intorno alla testa della mosca (frecce) per creare una soluzione salina a prova di tenuta. Se eventuali perdite saline fino ai proboscide della mosca, poi l&#39;esperimento avrà esito negativo. Il filo (frecce) legato alla fase è di tenere la proboscide in posizione, così che non è completamente retrazione<html> ted. Altrimenti sarebbe ostruire la parte più ventrale del SOG e causare artefatti da movimento. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> Figura 4. Top-view delle mosche con una mosca sezionato. Questa immagine mostra l&#39;esposto di SOG successivo alla rimozione delle cuticole mosca. L&#39;esofago, Muscle 16 e trachee collegato al cervello, nonchè selezionati aria sacchi sono stati rimossi per impedire loro di disturbare il cervello, che può portare a artefatti nei segnali di calcio. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;apparecchiatura di monitoraggio. Questo apparato è assemblato da un microscopio Olympus BX51WI collegata a un sistema di filatura microscopio confocale disco (Improvision), e un lato montato SMZ800 microscopio Nikon. Questa configurazione permette di live-imaging di attività cerebrale durante PER comportamento. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Fotografie per mostrare la vista laterale delle mosche. Lo strato sottile di soluzione fisiologica è inserita tra l&#39;acqua 40X-obiettivo a immersione e la mosca. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> Figura 7. Schema per la realizzazione del stoppino di carta Washi. Gampi-Washi carta è una pergamena tradizionale giapponese che è estremamente sottile e liscio (Haibara, Giappone). È anche molto forte e può mantenere una grande quantità di liquido. La carta Washi deve essere tagliato in un trapezio con dimensioni molto specifici 0,3 mm e 0,7 mm di larghezza, e 4-5 mm in lunghezza (a). Questo trapezoidale viene quindi inserita dal lato 0,7 millimetri nella punta di un ago ipodermico 23 e G può anche essere stabilizzate mediante l&#39;inserimento di un perno di insetto, che è piegata a forma di V (b). C, la carta Washi diventa trasparenti in seguito all&#39;esposizionead un liquido, che lo rende ideale per questo esperimento. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> Figura 8. La stimolazione della proboscide sulle vola alla Washi-stoppino. Lo stoppino di carta Washi sulla punta di un ago ipodermico viene applicata per un istante utilizzando un manipolatore joystick con una mano. L&#39;ago è collegata tramite un tubo flessibile ad un iniettore manipolato con l&#39;altra mano, per l&#39;aspirazione e lo scarico soluzione di saccarosio. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> Figura 9. Rappresentativi dei risultati. uno, PER comportamento registrato attraverso la camera CCD installato sul stereomicroscopio. Vista frontale di una mosca affamata con una proboscide estesi (frecce) prima della stimolazione, alla stimolazione, e dopo la stimolazione con uno stoppino contenente 100 mM saccarosio in soluzione acquosa (punta di freccia). L&#39;illuminazione è compiuta da un laser a 491 nm utilizzatoper GCaMP fluorescenza. b, saccarosio-indotta GCaMP 3,0 risposta nel neurone motore per il goniometro del muscolo rostro nello stato affamato. Il pannello superiore, la prima stimolazione, il pannello inferiore, immediatamente dopo la stimolazione. Bar Scala, 10 micron. C, Quantificazione del saccarosio indotta risposta GCaMP 3.0. Il neurone motore risponde ad uno stimolo saccarosio da un forte aumento nella fluorescenza seguita da una fase di ripristino di alcuni secondi per la linea di base.

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<p class="jove_content"&gt; Non ho nulla da rivelare.</p

Le MOSCHE consente la registrazione simultanea di Ca 2 + PER segnali e comportamenti. Anche con il cervello esposto a un comportamento normale soluzione salina è stata osservata. Utilizzando il Gampi-Washi stoppino al posto di uno stoppino Kimwipe utilizzato nel method7 originale capillare facilita un comportamento altamente riproducibile e stabile PER ed evita la necessità di diventare abili nel fare e la scelta di uno stoppino buona Kimwipe. Le punte sperimentali sopra indicato permesso di evitare perturbazioni con successo dal movimento della proboscide, portando a una registrazione molto stabile di Ca 2 + segnali a basso rumore. Di tanto in tanto, la rimozione dei tessuti non è stato sufficiente per esporre le cellule o sopprimere il movimento in maniera adeguata, porta a scarsi risultati. Tuttavia, una volta erano esperti, oltre l&#39;80% dei preparati prodotto buoni risultati. Questa metodologia è non solo per l&#39;imaging Ca 2 +, ma può anche essere adattata a qualsiasi immagine dal vivo osservando PER comportamento. Ad esempio, possiamo accedere a qualsiasi cella attraverso ilutilizzo di un elettrodo per registrare direttamente attività. In combinazione con due fotoni microscopia eccitazione, siamo in grado di effettuare l&#39;imaging lasso di tempo struttura sinaptica, che possono essere correlate a cambiamenti comportamentali. Pertanto, questo metodo di immagini cerebrali con osservazione del comportamento non è valida soltanto per la dissezione funzionale della rete neuronale, ma potrebbe essere usato come un potente strumento per correlare 14 plasticità sinaptica per i meccanismi alla base della memoria.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di attrezzature / Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar Vivadent </td><td> M04115 </td><td> Light-colla </td></tr><tr><td> BX51WI Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td> Con 40X (NA 0,8) lente dell&#39;obiettivo immersione in acqua </td></tr><tr><td> Spinning sistema di microscopia confocale disco </td><td> Improvision in PerkinElmer </td><td></td><td> Con il laser 491 nm </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ-800 </td><td> Attaccato ad un braccio oscillante. Visione stereo è ancora disponibile con registrazione video </td></tr><tr><td> Gampi-carta Washi </td><td> Haibara, Giappone </td><td></td><td> Un tipo speciale di carta tradizionale giapponese </td></tr><tr><td> CCD della fotocamera </td><td> Imaging Source </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 pixel CCD SONY </td></tr><tr><td> Joystick manipolatore </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettore </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

Per studiare reti neuronali in termini della loro funzione nel comportamento, dobbiamo analizzare come i neuroni funzionano quando ogni modello comportamentale viene generato. Così, registrazioni simultanee di attività neuronale e comportamento sono essenziali per correlare l&#39;attività del cervello al comportamento. Per tali analisi comportamentali, il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, ci consente di incorporare gli indicatori di calcio geneticamente codificate come GCaMP 1, per monitorare l&#39;attività neuronale, e di utilizzare sofisticate manipolazioni genetiche per le tecniche di optogenetic o termogenetica di attivare specificamente identificati neuroni 2-5. L&#39;uso di una tecnica termogenetica ci ha portato a trovare i neuroni fondamentali per comportamento alimentare (Flood et al., In corso di revisione). Come parte principale del comportamento alimentare, un adulto Drosophila estende la sua proboscide per l&#39;alimentazione 6 (estensione di risposta proboscide; PER), in risposta ad uno stimolo dolce da cellule sensoriali sulla sua proboscide o Tarsi. Combining il protocollo per PER 7 con una tecnica di imaging di calcio 8 utilizzando GCaMP3.0 1, 9, ho stabilito un sistema sperimentale, dove si può monitorare l&#39;attività dei neuroni nel centro nutrizionale - il ganglio suboesophageal (SOG), in contemporanea con l&#39;osservazione del comportamento della proboscide. Ho progettato un apparecchio (&quot;Fly cervello vivo Imaging e Stadio Elettrofisiologia&quot;: &quot;VOLA&quot;) per ospitare un adulto Drosophila, permettendo la sua proboscide di muoversi liberamente mentre il suo cervello è esposto al bagno per Ca 2 + immagini attraverso una lente di immersione in acqua . I MOSCHE è anche adatto per molti tipi di esperimenti dal vivo sul cervello mosca come la registrazione elettrofisiologica o lapse imaging momento della morfologia sinaptica. Poiché i risultati di immagini dal vivo può essere direttamente correlata con il comportamento PER simultanea, questa metodologia in grado di fornire un ottimo sistema sperimentale per studiare l&#39;elaborazione delle informazioni delle reti neuronali, e come questo cattività ellular è accoppiato ai processi di plastica e memoria.

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

La mosca della frutta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Si estende la sua proboscide per l&#39;alimentazione, rispondendo ad uno stimolo zucchero dalla sua proboscide o del tarso. Ho unito le osservazioni della risposta estensione proboscide (PER) con una tecnica di imaging di calcio, che ci permette di monitorare l&#39;attività dei neuroni nel cervello, in contemporanea con l&#39;osservazione comportamentale.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.6K Views.  University of Massachusetts Medical School. La mosca della frutta, Drosophila melanogaster, Si estende la sua proboscide per l'alimentazione, rispondendo ad uno stimolo zucchero dalla sua proboscide o del tarso. Ho unito le osservazioni della risposta estensione proboscide (PER) con una tecnica di imaging di calcio, che ci permette di monitorare l'attività dei neuroni nel cervello, in contemporanea con l'osservazione comportamentale.

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Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

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Neuroscienze

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Misurare risposte fisiologiche di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Immunologia e infezioni

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Preparazione della Drosophila melanogaster adulta per l'imaging cerebrale intero durante il comportamento e le risposte agli stimoli

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Monitoraggio degli eventi epilettiformi in Drosophila tramite imaging del calcio

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Autore in primo piano: approfondimenti sulle tecniche e sui risultati dei recenti progressi nella ricerca sull'epilessia 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

Misurare risposte fisiologiche di

Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Preparazione della Drosophila melanogaster adulta per l'imaging cerebrale intero durante il comportamento e le risposte agli stimoli

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila