Ich bedanke mich bei L Watanabe, M Gorczyca und andere Mitglieder der Yoshihara Labor für hilfreiche Kommentare und Diskussionen. Ich danke K. und L. Scott Looger für Fliegenfischer Aktien, S Yokoyama für den Nachweis der Experimente, Shinya Iguchi für technische Hilfe, und Nobuko Yoshihara für wesentliche Informationen. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Mental Health Grants MH85958, und der Worcester Foundation auf MY unterstützt

1. Der Bau der Fliegen <ol><li> Gestalten Sie eine Plattform aus dem Deckel von 35 mm Falcon Gericht durch Schmelzen der Seitenwand und Carving es, einen geeigneten Winkel und Dicke (Abbildung 1a, Abbildung 2) zu bilden. Ein Loch in der Plattform, die Fliege Kopf (1a, b), so dass die Mundwerkzeuge frei nach außen von der Kammer (1a) ausgesetzt zu akzeptieren. Schneiden Sie das Ende einer Pipetman Spitze, mit der Größe passend zur Fliege zu beachten. Kleben Sie die Spitze an der Plattform, wie in Abbildung 1a dargestellt, um die Fliegen (Abbildung 2) zu vervollständigen. </li></ol> 2. Vorbereiten des Fly for Observation <ol><li> Hungern einen erwachsenen Fliege für 24 Stunden bei 25 ° C vor dem Experiment, indem Sie es in einem Fläschchen mit nur einem feuchten Papiertuch, wenn Hunger ist notwendig. </li><li> Betäuben die Fliege, indem Sie es in einer 15ml Plastikröhrchen Stehen auf Eis. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie eine Fliege in der Kammer desFliegt, und schieben Sie die Fliege, bis sie unfähig sich zu bewegen ist. Dann wird ein Pfropfen, die Fliege zu behalten. (Abb. 1a, b). </li><li> Versiegeln Sie die umliegenden Teile der proximalen Rüssel (Rostrum) bis zur Innenkante des Loches; Eine kleine Menge von lichthärtenden Klebstoff (Tetric EvoFlow) zu den Seiten und über dem Rednerpult von außen (Pfeile in Abb. 3). Auch den Leim von der Innenseite der Fliegen in den Raum zwischen den dorsalen Teil des Kopfes und dem inneren Rand des Loches (1b). Damit das Rednerpult frei zu bewegen, sollte darauf geachtet werden, keinen Leim von der Berührung der Tribüne mit der Wimper zu (oder etwas Vergleichbares), um den Kleber zu verbreiten verhindern. Schließlich heilen Sie den Kleber mit dem schwächsten Bestrahlung mit blauem Licht ausreichend für die Heilung nicht zu beschädigen die Fliege vor übermäßiger Hitze. Ziehen Sie den Netzstecker. </li><li> Ein Thread auf die Tribüne teilweise angehoben (Pfeil in Abbildung 3) halten kann, um die Fliege zu stabilisieren &quot;Kopf durch die Vermeidung des Bump-Rachen-Teil zu SOG und den ventralen Teil des SOG aussetzen, vor allem für die Bildgebung präsynaptischen Enden der Nervenzellen Gr5a 8, die durch einen Teil des Rachens, wenn der Rüssel vollständig eingefahren abgedeckt sind. </li><li> Füllen der Oberfläche der Plattform mit einer zuckerfreien Salzlösung, enthaltend (in mM): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4,5; CaCl 2, 1,5 und HEPES-NaOH, 5 mit einem pH-Wert von 7,1 10. Das Saccharose-freie Kochsalzlösung hat ähnliche Tonus zu denen häufig verwendete Saccharose-haltige Salines wie HL3.1 11. </li><li> Öffnen Sie den Kopf Kapsel mit einem Wolfram-Klinge und Pinzette mit scharfen Spitzen wie eine Schere, die eine Sonderanfertigung ist und ursprünglich von Dr. Kageyuki Yamaoka, Japan, entwickelt, um die Nagelhaut schneiden und in der Luftröhre, um die SOG (Abbildung 4) freizulegen. Die ventralen Rand des Kopfes Kutikula wurde als ventrale wie möglich geschnitten, während die dorsalen Kante geschnitten war nicht so kritisch. Erstens, stellen einen Einschnitt durch diehinteren Rand mit einem Wolfram-Klinge. Dann, in der Seite abgeschnitten und die vorderen Kanten mit Hilfe der Pinzette geschärft. Der Schnitt Nagelhaut Stück sollte mit der Pinzette angehoben und entfernt werden. Antennen und antennalen Nerven sollte von den geschärften Zange geschnitten werden. </li><li> Um Bewegungsartefakte während Aufnahmen zu vermeiden, muss das Gehirn durch die Beseitigung von bestimmten Teilen der Fliege stabilisiert werden. Erstens, selektiv zu entfernen Luftsäcke zwischen der SOG und Nagelhaut. Schneiden der Speiseröhre am Ende in Richtung des Rachens und am Ende gehen in die SOG, um die Verbindung zwischen dem Pharynx und dem Gehirn zu entfernen. Dann ziehen Sie Muscle 16 12, und schließlich lösen keine Luftröhre verbindet das Gehirn und die Nagelhaut. </li><li> Wir setzen unsere Fliegen auf der Bühne einer Olympus BX51WI Mikroskop verbunden mit einem Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop-System (Improvision in PerkinElmer) (Abbildung 5). Ein Wasser-Immersionslinse, zB 40X/0.8 NA, wurde in das Bad (6 eingetaucht </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 +-Imaging of the Brain <ol><li> Ca 2 +-Imaging unter Verwendung GCaMP3.0 1, 9 wurde durch das Verfahren Marella et al errichtet wird. 8 (Abbildung 6). Mit einem Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop (Improvision), nehmen Sie einen einzelnen optischen Schnitt bei 4 Hz mit einer Belichtungszeit von 122ms mit 491nm Anregungslasers, wobei der Schwerpunkt auf der Region of Interest (eine Zelle Körper eines motorischen Neurons, oder ein Interneuron oder präsynaptischen von Geschmacks-sensorischen Neuronen) mit Velocity Software, Ver. 4,3 (Improvision). </li></ol> 4. Stimulierung der Proboscis <ol><li> Aspirieren 100 mM wässrige Saccharoselösung in einer Injektionsnadel mit einem kleinen Docht (aus Japanpapier, siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien), die von der Spitze (Abbildung 7). </li><li> Entladen Sie einen kleinen Tropfen Zuckerlösung auf den Docht, dann absaugen es, unmittelbar vor deme Anwendung des getränkten Docht Washi-Papier an der Spitze des Rüssels. Die Washi-Papier Docht sollte nur für einen Augenblick bis zur Sättigung (Abbildung 8) zu vermeiden, angewendet werden. Überwachen Sie die Proboscis extension response (PER) Verhalten mit einer CCD-Kamera, die an einem Dissektionsmikroskop (Abbildung 5) gleichzeitig mit Ca 2 +-Imaging. Die Daten müssen innerhalb einer Stunde nach Beginn der Dissektion, weil die pro Antwort wird nicht mehr als eine Stunde unter diesen Bedingungen gehalten genommen werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Motoneuronen des Rostrum Winkelmesser, ein Paar wichtigen Muskeln verantwortlich für die Aufhebung der Tribüne für Proboscis Extension, wurde berichtet, dass robuste Reaktionen auf Reize süßen 13 zeigen. Abbildung 9 zeigt, Ca 2 +-Signale durch GCaMP3.0 1, 9, ausgedrückt durch ein Gal 4-Treiber, E49 13, aus einem Zellkörper der Motoneuronen. Wie im Video, ein Robu gezeigtRunde PRO wurde synchron mit einem Anstieg der Ca 2 +-Signal beobachtet. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Gehirns Fly Live-Imaging und Elektrophysiologie Stage (Fliegen). A: Der FLIEGEN so gebaut, dass der Winkel der Wand für die Fliege den Kopf zu kommen geraden ermöglicht. Drei Segmente der Fliege Rüssel sind farblich gekennzeichnet, die Tribüne ist Magenta. Die Fliege in der Kammer wird mit einer Pinzette eingelegt, und ein Stück vom Ende einer Pipetman Spitze abgeschnitten ist an der Rückseite der Kammer, die Fliege an der Flucht zu blockieren. B, wird das Loch gebohrt, um an der Fliege Kopf entsprechen. Die verbleibenden Lücken werden mit einem lichthärtenden Klebstoff abgedichtet wie angegeben um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind. Nachdem der Kleber ausgehärtet ist, wird die Spitze Pipetman als Plug entfernt. Salzlösung wird in die FLIEGEN, dass die Oberfläche des Gehirns vollständig bedeckt gegossen. Es sollte sichergestellt werden, dass es keine Leckage Salzlösung werdenÝng hinaus auf das vordere Ende der Fliege Kopf. Der schraffierte Bereich durch die gestrichelte Linie im Diagramm b umgeben ist der Teil, um sich zu präparieren. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> Abbildung 2. Foto der Fliegen. Die halbmondförmigen Wand Klebstoff (von einer Klebepistole) wird um den Strom von Kochsalzlösung während der Perfusion zu steuern, und die Menge an Salzlösung, zu verringern. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> Abbildung 3. Frontansicht einer Fliege montiert in the Flies. Dieses Bild zeigt, wie eine Fliege in den Fliegen eingestellt ist, und wie die lichthärtende Kleber um den Kopf der Fliege (Pfeile), um eine Kochsalzlösung-Abdichtung schaffen wird. Wenn irgendwelche Lecks Kochsalzlösung durch den Rüssel der Fliege, dann das Experiment schlägt fehl. Das Gewinde (Pfeilspitzen) angebunden an der Bühne ist, um den Rüssel in Position zu halten, so dass es nicht vollständig Retraktion<html> Ted. Sonst wäre es behindern die mehr ventralen Teil des SOG und verursachen Bewegungsartefakte. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> Abbildung 4. Top-view of the Flies mit einer Fliege seziert. Dieses Bild zeigt den exponierten SOG einer Fliege folgenden Nagelhaut entfernen. Die Speiseröhre, Muskel 16 und Tracheen mit dem Gehirn verbunden, sowie ausgewählte Luft-Säcken wurden ebenfalls entfernt, um sie von Störung des Gehirns, die, um Artefakte in den Calcium-Signale führen kann verhindern. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> Abbildung 5. Die Vorrichtung zur Überwachung. Dieses Gerät wird von einem Olympus Mikroskop BX51WI an einem Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop-System (Improvision) montiert, und eine Nikon SMZ800 Mikroskop seitlich montierten. Dieser Aufbau ermöglicht die Live-Bildgebung von Hirnaktivität während PER Verhalten. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6. Fotos, um die Seitenansicht der Fliegen zu zeigen. Die dünne Schicht von Kochsalzlösung wird zwischen dem Wasser-40X Immersionslinse und der Fliege eingeklemmt. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> Abbildung 7. Schematische zur Herstellung des Washi-Papier Docht. Gampi-Washi-Papier ist ein traditionelles japanisches Pergament, die extrem dünn und glatt (Haibara, Japan) ist. Es ist auch sehr stark und kann eine große Menge an Flüssigkeit zu halten. Die Washi-Papier muss in ein Trapez mit sehr spezifischen Abmessungen geschnitten werden; 0,3 mm und 0,7 mm in der Breite und 5.4 mm in der Länge (a). Diese trapezförmige wird dann von der Seite 0,7 mm in die Spitze einer subkutanen Nadel 23 G eingesetzt und kann auch durch die Einfügung eines Insekts Stift, der mit einer V-Form (b) gebogen ist, stabilisiert werden. C wird das Papier Washi transparent nach Expositionzu einer Flüssigkeit, wodurch es ideal für dieses Experiment. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> 8. Die Stimulation des Rüssels an den Fliegen mit dem Docht-Washi. Die Washi Papier Docht an der Spitze einer subkutanen Nadel für einen Augenblick mit dem Joystick Manipulator mit einer Hand aufgebracht. Die Nadel wird durch einen Schlauch mit einem Injektor mit der anderen Hand manipuliert verbunden ist, zum Ansaugen und Abgeben Saccharoselösung. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> Abbildung 9. Repräsentative Ergebnisse. ein, PER Verhalten durch die CCD-Kamera auf dem Stereomikroskop installiert aufgezeichnet. Frontalansicht eines verhungerten Fliege mit einem erweiterten Rüssel (Pfeile) vor der Stimulation, bei der Stimulation und nach der Stimulation mit einem Docht, der 100 mM Saccharose wässrigen Lösung (Pfeilspitze). Die Beleuchtung wird von einem 491-nm-Laser verwendet, erreichtfür GCaMP Fluoreszenz. b, 3,0 GCaMP Reaktion im motorischen Neurons für den Winkelmesser der Tribüne Muskel im ausgehungerten Zustand Saccharose-induziert. Die obere Platte, vor der Stimulation, die Bodenplatte, unmittelbar nach der Stimulation. Scale-Bar, 10 um. C, Quantifizierung des Saccharose-induzierte 3,0 GCaMP Antwort. Der Motor Neuron reagiert auf einen Saccharose-Stimulus von einem starken Anstieg in der Fluoreszenz durch eine Restaurierung Phase von mehreren Sekunden bis zur Grundlinie folgte.

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<p class="jove_content"&gt; Ich habe nichts zu offenbaren.</p

Die Fliegen ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von Ca 2 +-Signale und PRO Verhalten. Auch mit dem Gehirn ausgesetzt Kochsalzlösung normalen PRO wurde beobachtet. Verwenden des Gampi-Washi Docht anstelle von einem Kimwipe Docht in der ursprünglichen Kapillare verwendet method7 ermöglicht eine hoch reproduzierbare und stabile PRO Verhalten und vermeidet die Notwendigkeit, sich bei der Gestaltung und der Auswahl einer Kimwipe Docht Fachmann. Die experimentellen Spitzen oben erwähnt erlaubt es uns, erfolgreich zu vermeiden Störungen durch die Bewegung des Rüssels, was zu einer sehr stabilen Aufnahme von Ca 2 +-Signale mit geringer Geräuschentwicklung. Gelegentlich wurde Gewebeentfernung nicht ausreicht, um Zellen zu exponieren oder zu unterdrücken Bewegung ausreichend, was zu schlechten Ergebnissen. Allerdings, wenn wir qualifizierte waren, produzierte mehr als 80% der Präparate gute Ergebnisse. Diese Methode ist nicht nur für Ca 2 +-Imaging, kann aber auch zu jedem Live-Bildgebung angepasst werden unter Beachtung PRO Verhalten. Zum Beispiel können wir auf eine beliebige Zelle durch dieVerwendung einer Elektrode zur direkten Aufzeichnung Aktivität. Kombiniert mit zwei-Photonen-Anregung Mikroskopie, sind wir in der Lage, Zeitraffer-Aufnahme von synaptischen Struktur, die zu Verhaltensänderungen in den Bereichen durchführen können. Daher ist diese Methode der Bildgebung des Gehirns mit Verhaltensbeobachtung nicht nur wertvoll für die funktionale Zerlegung des neuronalen Netzes, könnten aber als ein mächtiges Werkzeug, um synaptische Plastizität 14 zu den Mechanismen, die hinter Speicher korrelieren verwendet werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name der Anlage / Reagent </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar Vivadent </td><td> M04115 </td><td> Lichthärtendes Leim </td></tr><tr><td> BX51WI Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> BX51WI </td><td> Mit 40x (NA 0,8) Wasser Immersionsobjektivlinse </td></tr><tr><td> Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop-System </td><td> Improvision in PerkinElmer </td><td></td><td> Mit 491 nm Laser </td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ-800 </td><td> An einem Schwenkarm. Stereo-Sicht ist noch verfügbar mit Videoaufzeichnung </td></tr><tr><td> Gampi-Washi-Papier </td><td> Haibara, Japan </td><td></td><td> Eine besondere Art der traditionellen japanischen Papier </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Imaging Source </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 Pixel SONY CCD </td></tr><tr><td> Joystick Manipulator </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> Injector </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

Um neuronale Netze im Hinblick auf ihre Funktion im Verhalten zu studieren, müssen wir analysieren, wie Neuronen, wenn jedes Verhaltensmuster erzeugt betreiben. Damit sind simultane Aufnahmen von neuronaler Aktivität und Verhalten wesentlich für die Hirnaktivität, um das Verhalten korrelieren. Für solche Verhaltens-Analysen, ermöglicht die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, uns genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wie GCaMP 1 integrieren, um neuronale Aktivität zu überwachen und zu anspruchsvoll für genetische Manipulationen oder optogenetische thermogenetisch Techniken verwenden, um speziell Neuronen identifiziert 5.2 aktivieren. Die Verwendung eines thermogenetisch Technik hat uns dazu veranlasst, kritisch Neuronen für Fressverhalten (Flood et al., In Überarbeitung) zu finden. Als Hauptteil des Fressverhalten, erstreckt sich ein Erwachsener Drosophila ihrem Rüssel für die Zuführung 6 (Proboscis Extension Response; PER), der einem süßen Reiz aus Sinneszellen auf ihrem Rüssel oder Tarsen. Combining das Protokoll für PRO 7 mit einem Kalzium-Imaging-Technik mit 8 GCaMP3.0 1, 9, habe ich ein experimentelles System, in dem wir Aktivität von Neuronen im Ernährungszentrum überwachen können etabliert - die Subösophagealen Ganglion (SOG), gleichzeitig mit Verhaltensbeobachtung des Rüssels. Ich habe ein Gerät (&quot;Fly Gehirn Live-Imaging und Elektrophysiologie Stage&quot;: &quot;fliegt&quot;) entwickelt, um eine Drosophila Erwachsenen unterbringen, so dass ihrem Rüssel, sich frei zu bewegen, während sein Gehirn ist mit dem Bad für die Ca 2 +-Imaging ausgesetzt durch ein Wasserbad Immersionslinse . Die Fliegen ist auch geeignet für viele Arten von Live-Experimente auf Fliegenhirn wie elektrophysiologische Ableitung oder Zeitraffer-Aufnahme von synaptischen Morphologie. Da die Ergebnisse von Live-Bildgebung kann direkt mit der gleichzeitigen PRO Verhalten korreliert werden, kann diese Methode eine ausgezeichnete experimentelles System zur Verarbeitung von Informationen in neuronalen Netzwerken zu untersuchen, und wie diese cextrazelluläres Tätigkeit sich auf Kunststoff-Prozesse und Speicher gekoppelt.

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Die Fruchtfliege,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Erweitert sein Rüssel für die Zuführung, der einem Zucker Reiz aus ihrem Rüssel oder Tarsus. Ich habe Beobachtungen der Rüssel Ausweitung Antwort (PER) mit einem Calcium-Imaging-Technik kombiniert, so dass wir die Aktivität von Nervenzellen im Gehirn zu überwachen, gleichzeitig mit Verhaltensbeobachtung.

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.6K Aufrufe.  University of Massachusetts Medical School. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, Erweitert sein Rüssel für die Zuführung, der einem Zucker Reiz aus ihrem Rüssel oder Tarsus. Ich habe Beobachtungen der Rüssel Ausweitung Antwort (PER) mit einem Calcium-Imaging-Technik kombiniert, so dass wir die Aktivität von Nervenzellen im Gehirn zu überwachen, gleichzeitig mit Verhaltensbeobachtung.

Serie: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Forschung

Neurowissenschaften

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Mess physiologischen Reaktionen von<em&gt; Drosophila</emNeurone&gt; Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Immunologie und Infektion

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Gleichzeitige Langzeit-Aufnahmen auf zwei neuronale Verarbeitungsstufen in Behaving Honigbienen

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Überwachung epileptiformer Ereignisse in Drosophila mittels Calcium-Bildgebung

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Autor im Rampenlicht: Einblicke in die Techniken und Erkenntnisse der jüngsten Fortschritte in der Epilepsieforschung 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Mess physiologischen Reaktionen von

Gleichzeitige Langzeit-Aufnahmen auf zwei neuronale Verarbeitungsstufen in Behaving Honigbienen

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie