Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute (K08CA140946, a YC), (5F32CA130372, per PC), (R01CA102774 e R01HL055748 a PB), il Dipartimento della Difesa (PC094302 a YC), il Fondo Famiglia Shuman per la Ricerca GIST (a PC), e il Consorzio Cancro Starr (per PC, YC, CLS e PB). Vorremmo ringraziare Katia Manova, Fan Ning, e Mesurh Turkekul della struttura molecolare di base MSKCC Citologia aiuto per criosezionamento e immunocolorazione.

1. Dissezione di mouse tratto gastrointestinale <ol><li> Topi da locali in materia di eutanasia IUCAC </li><li> Pin ogni arto sulla superficie di polistirolo e risciacquare superficie addominale con il 70% di etanolo. Aprire cavità addominale con incisione lungo la linea mediana dal diaframma al pube. Fare un&#39;alzata al esofago distale e un secondo taglio a livello intestinale distale di grandi dimensioni e rimuovere il tratto gastrointestinale dallo stomaco all&#39;ano in blocco, con attenzione al taglio dei legamenti del duodeno e cieco con piccole forbici. Luogo tratto gastrointestinale in una piastra di Petri con PBS. Sezionare via mesentere con pinzette (Figura 1). Per separare stomaco, intestino tenue e intestino crasso, tagliato a piloro e la giunzione ileocecale. Sciacquare il lume di ogni parte del tratto gastrointestinale con PBS usando una siringa da 5 ml collegata ad un ago di alimentazione (topi più anziani) o un ago senza punta (più giovani topi). </li><li> Stomaco aperto, intestino tenue e intestino crasso, lungo il confine mesenterica. Tagliate due pezzi per ogni parte del tratto gastrointestinale, una per la visualizzazione montare tutto e uno per cryosection. </li></ol> 2. Tutto montare la preparazione del campione e immunocolorazione <ol><li> Posizionare il pezzo intero di ogni parte del tratto gastrointestinale in un tubo di 1,5 centimetri microcentrifuga riempito con 1,0 ml di acetone ghiacciate e campioni correzione per almeno 1 ora a 4 ° C. I campioni possono essere conservati per un massimo di 1 settimana a -20 ° C. Noi di solito conservare i campioni in acetone e procedere per preparare cyrosections. </li><li> Lavare 2X campione con PBS. Collocare il campione in capsula di Petri con PBS. Sotto dissezione miscroscope, con attenzione raschiare strato mucoso con un bisturi tenendo una estremità con un paio di pinzette, lascia la tonaca muscolare. </li><li> Muscolo può essere tagliato in pezzi 5mm per colorazione con anticorpi diversi. Non conservare per più di 2 giorni in PBS prima della colorazione. </li><li> Passi blocco e l&#39;incubazione può essere fatto in un pozzetto di un 24-pozzetti o in una provetta per microcentrifuga 1,5 ml. Blocco con 0,5 ml di tampone di bloccaggio (siero di capra al 5%, 0,1% Triton X-100 in PBS per 1 ora a 4 ° C). </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio e ruotare la notte a 4 ° C. Abbiamo utilizzato con successo ACK-2 Kit anti-ratto, coniglio anti-Ano1, e di coniglio anti-PGP9.5 anticorpi per immunostaining monte tutto. </li><li> Lavare per almeno 2X 5 con PBS sul rotore a temperatura ambiente. </li><li> Incubare con anticorpo secondario diluito in tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente su rotatori. Noi in genere utilizzano Alexa Fluor 488 anti-coniglio e Alexa Fluor 594 anticorpi anti-topo. </li><li> Lavare per 15 minuti 3 volte con PBS su rotatori a temperatura ambiente. </li><li> Montare sulla slitta, lato sierose sulla parte superiore per garantire l&#39;orientamento del tessuto durante la microscopia. Questo orientamento garantirà il lato sierose per affrontare il coprioggetto ed essere incontrati prima come ci si concentra nella diapositiva su un microscopio. Facciamo questo in un microscopio da dissezione. A volte, abbiamo brevemente esaminare il tessuto al microscopio a fluorescenza per orientare correttamente. Al microscopio a fluorescenza per visualizzare Kit o Ano1, si dovrebbe incontrare il CPI-MY prima rete dal lato del coprioggetto. Avanti, aspirare PBS per quanto possibile, senza asciugare completamente. Aggiungere 50 ml di set di supporti di montaggio duro (usiamo Prolungare Gold) e poggiate delicatamente scivolare coperchio sulla parte superiore del tessuto. Permettere l&#39;impostazione di montaggio durante la notte a temperatura ambiente e conservare i vetrini a -80 ° C. </li><li> Per l&#39;esame microscopico, abbiamo usato un microscopio a campo largo con una Z-drive. Abbiamo usato sia un obiettivo 20X aria (NA 0.75, apocromatico piano) o olio obiettivo 60X (NA 1.4, apocromatico piano) e preso 2 micron o 1 micron Z-sezioni che coprono l&#39;intero muscolare. Le immagini sono state successivamente deconvoluted utilizzando il software Autoquant deconvoluzione. In alternativa, molti altri hanno usato la microscopia confocale, invece, con risultati simili. </li></ol> 3. Cryosection preparazione e immunocolorazione <ol><li> Luogo ogni parte del tratto gastrointestinale, lato sierose verso il basso, piatto su carta da filtro. Tagliare la carta da filtro di tutto il tessuto. Tessuto posto su carta da filtro nel 4% paraformaldeide (PFA) in PBS (noi diluire 32% paraformaldeide in flaconcino sigillato in PBS a destra prima dell&#39;uso) per 2 ore a temperatura ambiente. Fissaggio può essere fatto in un 6 - o 12-pozzetti a seconda delle dimensioni del tessuto, o in un tubo microcentrifuga 1,5 ml. Se fatto in lamiera, parafilm per minimizzare l&#39;esposizione PFA. Tempi di fissazione più lunga può portare a mascherare l&#39;antigene, in particolare per l&#39;ACK-2 anti-kit di anticorpi. </li><li> Rimuovere il tessuto da PFA e luogo nel 30% di saccarosio in PBS. Lasciare tessuto ad affondare durante la notte a 4 ° C. </li><li> Equilibrare tessuto con rapporto 1:1 del 30% saccarosio e ottobre per 1 ora. Quindi montare il tessuto in verticale cryomold pieno di ottobre L&#39;asse longitudinale del tratto gastrointestinale va in parallelo con la cyrosections. Nell&#39;esaminare topi con differenti genotipi o con diversi trattamenti, può essere utile per montare il tessuto da diversi tipi di mouse sul cryomold stesso per assicurare l&#39;elaborazione parallela. Congelamento in ghiaccio secco e mettere in freezer -80 ° C per la conservazione. </li><li> Tagliare 10 criosezioni micronsul vetrino e conservare congelatore a -80 ° C. Noi di solito tagliato due sezioni per vetrino. Noi di solito procedere alla colorazione H &amp; E di una diapositiva cryosection. </li><li> Per immunofluorescenza, prima equilibrare scivolo a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi disegnare cerchio intorno al tessuto usando penna PAP. </li><li> Blocco con 150 ml di tampone di bloccaggio (come per tutta la immunostaining montaggio) per 1 ora. </li><li> Aspirare il tampone di bloccaggio e aggiungere 150 microlitri anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio e incubare una notte a 4 ° C in una camera umidificata. </li><li> Lavare 5 min 2X con PBS. </li><li> Incubare con anticorpo secondario diluito in tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente. Noi in genere utilizzano Alexa 488 anti-coniglio e Alexa 594 anticorpi anti-topo. </li><li> Lavare per 15 minuti 3 volte con PBS. </li><li> Aspirare senza scivolare completamente l&#39;essiccazione dei tessuti. Aggiungere una goccia di serie dura montaggio di mezzi con DAPI (usiamo Prolungare Gold) e posto # 1.5 coprioggetti. Porre il vetrino a temperatura ambiente per una notte per impostare e conservare in congelatore -80 ° C. </li><li> Acquisire immagini tripla fluorescenza con DAPI, FITC e Texas Red set di filtri. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Qui, usiamo l&#39;intestino crasso come esempio. H &amp; E macchia di saccarosio protetto fisso sezione congelata utilizzata per immunofluorescenza mostra alcuni artefatti rispetto ad una sezione di paraffina di riferimento (Figura 2), dove la linea gialla demarks plesso mioenterico tra gli strati muscolari circolari e longitudinali e la demarks linea verde al confine tra le mucosa e muscularlis. Esaminando il cryosection, dalla sierosa a mucosa, è più sottile del primo incontro longitudinale muscolare (LM) strato seguito da spessore del muscolo circolare (CM) strato. La sezione dovrebbe essere in parallelo con il muscolo longitudinale in modo che il nucleo di LM dovrebbe essere un po &#39;allungata, mentre i nuclei delle CM deve essere piccolo e rotondo. Tra la LM e CM sono plexi mioenterico fatta di neuroni che macchia con PGP9.5. PGP9.5 anche i processi neuronali macchie in tutto il CM. Il mioenterico ICC rete (ICC-MY) circondano il plesso mioenterico e sono fatti di cellule multipolare. All&#39;interno dello strato muscolare longitudinale, ci sono rari ICC intramuscolare (IM-ICC), che sono cellule bipolari in parallelo con il muscolo. All&#39;interno dello strato muscolare circolare, ci sono abbondanti ICC-IM che sono anche le cellule bipolari che corrono paralleli con il muscolo circolare e sono sezionato con questo taglio. All&#39;incrocio tra la tonaca muscolare e la sottomucosa, la rete sottomucosa CPI composta da ICC-SMP è una rete di piatto ICC multipolare. Esaminando l&#39;intero kit di montaggio immunocolorazione del grosso intestino, ci si dovrebbe aspettare di incontrare l&#39;ICC-MY prima rete, e poi il CPI-IM della CM, e ICC-SMP reti, ci si concentra dal coprioggetto (Figure. 3) . Misura volumetrica delle reti di ICC con ricostruzione in 3D di interi montare le immagini sono state descritte 10. Utilizzando a grande campo microscopio, vi sia una significativa out-of-plane fluorescenza nelle immagini prima che può essere rimosso dopo deconvoluzione (figura 3). Incompleta stripping della mucosa si tradurrà in fluorescenza di fondo elevato. ANO1 è un altro marker della Corte penale internazionale e co-immunocolorazione di KIT e ANO1 mostra sovrapposizione completa di colorazione ICC (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Rappresentante Figura 1. Sezionato tratto gastrointestinale del mouse, ristampato con il permesso 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. A) Rappresentante colorazione H &amp; E della intestino del mouse di grandi dimensioni di criosezioni preparato come descritto e paraffina riferimento incorporato sezione che mostra alcuni manufatti restringimento di criosezioni. Il demarks linea gialla del plesso mioenterico e la linea blu separa la mucosa dalla muscolare. B) Rappresentante Kit (rosso, ACK-2) e PGP9.5 (verde) immunofluorescenza doppia con DAPI (blu) di contrasto dell &#39;intestino del mouse di grandi dimensioni. LM: CM longitudinale muscolare: muscolo circolare. Scala bar 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Rappresentante Kit (rosso, ACK-2) con tutto il montaggio immunofluorescenza dello stesso campo a tre piani focali, l&#39;ICC-il mio aereo a LM / CM confine, l&#39;ICC-IM aereo nel CM, e la CPI- aereo SMP al CM / sottomucosa confine. Immagini RAW e le immagini deconvoluted sono mostrati. Scala bar 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Rappresentante doppia immunofluorescenza di Ano1 (verde) e Kit (rosso, ACK-2) nel grande intestino. Scala bar 20 micron.

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	<li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract.">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li><li>Ward, S. M., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+interstitial+cell+of+Cajal:+from+bench+to+bedside.+I.+Functional+development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal+networks.">Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).</li><li>Komuro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+gastrointestinal+tract.">Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract.</a> J Physiol. 576, 653-658 (2006).</li><li>Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal.">Development and plasticity of interstitial cells of Cajal.</a> Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).</li><li>Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+proto-oncogene+c-kit+blocks+development+of+interstitial+cells+and+electrical+rhythmicity+in+murine+intestine.">Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine.</a> J Physiol. 480, 91-97 (1994).</li><li>Huizinga, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W/kit+gene+required+for+interstitial+cells+of+Cajal+and+for+intestinal+pacemaker+activity.">W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity.</a> Nature. 373, 347-349 (1995).</li><li>Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumour.">Gastrointestinal stromal tumour.</a> Lancet. 369, 1731-1741 (2007).</li><li>Hirota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+of+c-kit+in+human+gastrointestinal+stromal+tumors.">Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.</a> Science. 279, 577-580 (1998).</li><li>Chi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV1+is+a+lineage-specific+survival+factor+in+Gastrointestinal+Stromal+Tumour+(GIST).">ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST).</a> Nature. , (2010).</li><li>Kwon, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ano1+is+a+selective+marker+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).</li><li>Sommer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Cellule interstiziali di Cajal sono stati inizialmente caratterizzati da Santiago Ramóón y Cajal esattamente un secolo fa con le macchie cromato di blu di metilene e l&#39;argento di muscolare gastrointestinale. Cajal inizialmente pensato CPI sono stati i neuroni in base al loro processi che ricordano di assoni e dendriti. Nel corso di molti anni successivi, lo studio della biologia ICC è stato limitato dalla mancanza di marcatori specifici fino alla scoperta di questo KIT non solo si esprime in ICC, ma è necessario anche per il loro sviluppo 6. Da allora, KIT immunofluorescenza è stato ampiamente utilizzato nello studio della biologia e della Corte penale internazionale ha portato anche l&#39;apprezzamento della ICC in altri organi contrattili come la vescica urinaria. Recentemente, ANO1 è stato identificato come un secondo marcatore affidabile ICC. Ci sono state numerose pubblicazioni negli ultimi 15 anni, utilizzando l&#39;immunofluorescenza per identificare ICC con la fissazione vari e tecniche di montaggio. Nelle nostre mani &quot;fisso-congelato&quot; criosezioni che sono stati prefissati con paraformaldeide e saccarosio protette funziona meglio rispetto al acetone o paraformaldeide post-fissazione dopo criosezionamento. Per i montaggi tutto, abbiamo trovato che la fissazione di acetone mediante dissezione della mucosa dà i risultati più robusti. Storicamente, l&#39;ACK-2 è stato l&#39;anticorpo Kit di scelta per l&#39;identificazione del mouse ICC. Si tratta di un topo monoclonale che riconosce il dominio extracellulare ed è anche un anticorpo che causa il blocco ileo quando somministrato a vivere topi. Tuttavia, l&#39;ACK-2 epitopo viene lentamente distrutto da fissazione paraformaldeide e non viene salvato da metodi standard di recupero dell&#39;antigene. Abbiamo scoperto che l&#39;ACK-4 epitopo è più resistente alla fissazione paraformaldeide. Rispetto al fisso blocchi congelati e sezioni, blocchi di paraffina e le sezioni morfologia conserva meglio ed è più suscettibile di archiviazione a lungo termine (Figura 4). Né ACK ACK-2-4, né sono stati utilizzati con successo in sezioni di paraffina. Abbiamo caratterizzato che D13A2, un anticorpo monoclonale di coniglio nuovo, funziona particolarmente bene in entrambe le sezioni fisse congelati e paraffina del tratto gastrointestinale. Kit è espresso in diversi altri tipi cellulari, tra cui i melanociti, cellule ematopoietiche, cellule germinali e, in particolare mastociti, che si trovano anche nel tratto GI. Fortunatamente, le cellule si trovano la maggior parte dell&#39;albero è la mucosa e non nella muscolare. Colorazione doppia con coniglio anti-topo Ano1 e anti-kit in grado di eliminare marcatura non specifica di ciascun anticorpo (Figura 4). E &#39;anche interessante notare che l&#39;espressione relativa di kit e Ano1 tra sottoclassi di ICC sembra diverso. Per esempio, nel piccolo intestino, la colorazione Kit è molto più intensa in mioenterico ICC rispetto al CPI del muscolo plesso profondo mentre Ano1 colorazione è comparabile.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> ratto anticorpi anti-Kit (ACK clone-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> L&#39;uso ad 2μg/ml. Epitopo è perduto con overfixation. </td></tr><tr><td> ratto anticorpi anti-Kit (ACK clone-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> L&#39;uso ad 2μg/ml. </td></tr><tr><td> coniglio anti-KIT anticorpi (clone D13A2) </td><td> Cell Signaling </td><td> 3074 </td><td> L&#39;uso ad diluizione 1:100. Anticorpi elencati solo qui che funziona bene in sezioni di paraffina. </td></tr><tr><td> coniglio anti-PGP9.5 anticorpi </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Etichette citoplasma delle cellule neuronali. Utile per contrassegnare i neuroni del plesso mioenterico. L&#39;uso ad diluizione 1:1000. </td></tr><tr><td> coniglio anti-Ano1 anticorpi </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> L&#39;uso ad 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 di capra anti-topo IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> L&#39;uso ad 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> L&#39;uso ad 2μg/ml </td></tr><tr><td> L&#39;alimentazione degli animali Needle </td><td> Pescatore </td><td> 01-208-87 </td><td> Silicon punta dell&#39;ago utile per il lavaggio del tratto gastrointestinale di topi adulti </td></tr><tr><td> Blunt Needle </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Ago Blunt utile per il lavaggio del tratto GI di pre-svezzamento cuccioli </td></tr><tr><td> Prolungare reagente Oro Antifade con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> Possono utilizzare alternativa hard-impostazione del supporto di montaggio con DAPI </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryomold </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek ottobre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 32% paraformaldeide (fiala da 10 ml sigillato) </td><td> EM Scienze </td><td> 15714 </td><td> Aperto fiala sigillata e diluire al 4% appena prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Tampone bloccante </td><td></td><td></td><td> Siero di capra al 5%, 0,1% Triton X-100 in PBS </td></tr></tbody></table>

visualization of the interstitial cells of cajal (icc) network in mice

Le cellule interstiziali di Cajal (ICC) sono mesenchimali derivate &quot;cellule pacemaker&quot; del tratto gastrointestinale (GI) che generano spontanei onde lente necessaria per la peristalsi e mediare ingresso neuronali dal sistema1 nervoso enterico. Diversi sottotipi di ICC forma reti distinte nella muscolare del tratto gastrointestinale 2,3. Perdite o danni a queste reti è associato con una serie di disturbi della motilità 4. ICC cellule esprimono il recettore tirosin-chinasi KIT sulla membrana plasmatica e KIT immunocolorazione è stata utilizzata negli ultimi 15 anni per l&#39;etichetta della rete ICC 5,6. È importante sottolineare che l&#39;attività KIT normale è necessario per lo sviluppo ICC 5,6. Trasformazione neoplastica delle cellule ICC risultati in tumori stromali gastrointestinali (GIST), che spesso porto guadagno di funzione mutazioni KIT 7,8. Abbiamo recentemente dimostrato che ETV1 è un lignaggio specifico fattore di sopravvivenza espresso nel lignaggio ICC / GIST ed è un regolatore trascrizionale maestro necessari sia per la formazione normale rete ICC e della tumorigenesi GIST 9. Abbiamo inoltre dimostrare che collabora con mutazioni attivanti KIT nella tumorigenesi. Qui, descriviamo i metodi per la visualizzazione delle reti di ICC nei topi, in gran parte sulla base di protocolli precedentemente pubblicato con il 10,11. Più recentemente, il canale del cloro anoctamin 1 (ANO1) è stato caratterizzato come un marker specifico di membrana ICC 11,12. A causa della loro localizzazione membrana plasmatica, immunofluorescenza di entrambe le proteine ​​possono essere usate per visualizzare le reti ICC. Qui, descriviamo la visualizzazione delle reti ICC da fisso cyrosections congelati e preparati montare tutto.

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Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Le cellule interstiziali di Cajal (ICC) sono le cellule pacemaker del tratto gastrointestinale (GI). Essi formano reti complesse tra le cellule muscolari lisce e fibre neuronali post-gangliari per regolare contrattilità gastrointestinale. Qui vi presentiamo metodi di immunofluorescenza trasversale e con tutto il supporto di visualizzazione murini reti ICC.

Visualizzazione delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) di rete in topi

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

visualization-of-the-interstitial-cells-of-cajal-icc-network-in-mice

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Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

54.4K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Le cellule interstiziali di Cajal (ICC) sono le cellule pacemaker del tratto gastrointestinale (GI). Essi formano reti complesse tra le cellule muscolari lisce e fibre neuronali post-gangliari per regolare contrattilità gastrointestinale. Qui vi presentiamo metodi di immunofluorescenza trasversale e con tutto il supporto di visualizzazione murini reti ICC.

Video: Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

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A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

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Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

Congelamento, lo scongelamento, e celle di imballaggio per il trasporto

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualizzazione dei G3BP stress Granuli Dynamics in cellule primarie in diretta

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Visualizzazione delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) di rete in topi

Riepilogo

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Conteggio e determinazione della vitalità delle cellule in coltura

Trypsinizing e Trapianto cellule di mammifero

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Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae

Generazione di topi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

Visualizzazione e l'analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

Visualizzazione dei G3BP stress Granuli Dynamics in cellule primarie in diretta

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