Piscina progettazione e oligo recupero <ol><li> Il primo passo è quello di progettare il pre-mRNA piscina da studiare. Questo può essere fatto utilizzando il browser UCSC Genome e il download di particolari geni, giunzioni di splicing, o altre aree di interesse. </li><li> Una volta che le finestre di interesse sono stati selezionati, attraverso le piastrelle computazionalmente con le seguenti: lunghezza leggere dovrebbe essere di 30 nucleotidi con un 10 sovrapposizione nucleotide, quindi ogni oligo è spostato dal 20 nucleotidi prima uno. * Sovrapposizione Oligo deve essere aumentata in prossimità di siti di splicing per assicurare un&#39;adeguata copertura, aumentando la sovrapposizione 10-20 nucleotidi può realizzare questo. </li><li> Fianco ogni 30 oligo-nucleotidi con sequenze primer universale, che verrà utilizzato per amplificare la valle piscina. Piastrelle ordini oligo devono essere presentate alla Agilent, dove le sequenze verrà stampato su un oligonucleotide microarray su ordinazione. </li><li> Per recuperare il DNA oligo dalla superficie del microarray di iniziare a collocarlo nella diapositiva copertura matrice in una camera di ibridazione di array e delicatamente pipettaggio 500 ml di dH 2 O sul vetrino </li><li> Panino della matrice su parte superiore della diapositiva copertura, avendo cura di evitare bolle d&#39;aria che possono interferire con il processo. Assicurarsi di posizionare il volto serie giù in modo che il lato con l&#39;oligo sta toccando la superficie dell&#39;acqua. Una buona regola è &quot;Agilent tocca Agilent&quot;, che significa che l&#39;etichetta Agilent sulla matrice si affaccia l&#39;etichetta Agilent sul vetrino di copertura </li><li> Chiudere la camera di ibridazione e ruotare la notte a 99 ° C in un fornetto </li><li> Il giorno seguente, rimuovere con attenzione l&#39;array dalla camera e di erogare l&#39;acqua, che ora contiene le oligo liberato dalla superficie dell&#39;array. Questa è la piscina oligo </li><li> Posizionare la piscina in una provetta 1,5 ml Eppendorf e sonicare la piscina al 50% di ampiezza per 3-5 impulsi secondo </li><li> Successivamente, amplificare la vasca di ciclo PCR bassa, utilizzando il primer universale con un tag T7 aggiunto alla fine. Per il primo turno, denaturare a 94 ° C per 1 minuto, annealing a 55 ° C per 20 secondi, e allungare per 1 minuto a 72 ° C. Per i turni successivi, fare 10 secondi, 20 secondi e 10 secondi a ciascuna temperatura rispettivamente, con un passo allungamento finale di 5 minuti a 72 ° C. Poiché il numero di cicli necessari per amplificare la piscina dipende l&#39;efficienza di recupero oligo, può essere necessario per cercare i numeri ciclo multipli. Fare attenzione a non a un eccesso di amplificare la piscina, che è significata da una banda spalmato su un gel di acrilammide. Campioni di PCR amplificato può essere conservato a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> La fase finale in preparazione oligo è quello di trascrivere l&#39;RNA utilizzando il kit MEGAshortscript ™ da Ambion. * Il seguente protocollo è stato adattato da Ambion <ol class="lalpha"><li> Scongelare il tampone di reazione 10x T7, quattro soluzioni ribonucleotide e acqua a temperatura ambiente, mantenendo la miscela enzimatica T7 su ghiaccio </li><li> Montare la miscela di reazione in un RNasi-free provetta a temperatura ambiente. Componenti del tampone di reazione può causare DNA stampo per precipitare se la reazione è mista su ghiaccio. </li><li> Nel seguente ordine, pipetta 3 ml acqua priva di nucleasi, 2 l di buffer di reazione 10x, 2 ml di soluzione ogni 75 mm NTP, 5 ml di DNA stampo (la piscina oligo amplificato PCR) e 2 ml di T7 enzima, per un volume finale di 20 l </li><li> Flick il tubo delicatamente per mescolare la reazione poi brevemente microcentrifuga per raccogliere il composto sul fondo della provetta. </li><li> Incubare la reazione in un termociclatore a 37 ° C per 2 ore. Tempo di incubazione sarà modello-dipendente, per cui può essere necessario utilizzare un time-corso esperimento per determinare il tempo ottimale di incubazione per la resa massima </li><li> Dopo 2 ore, rimuovere il DNA stampo con l&#39;aggiunta di 1 ml di DNasi Turbo alla reazione e incubare a 37 ° C per altri 15 minuti </li><li> Terminare la reazione e recuperare l&#39;RNA per estrazione fenolo / cloroformio e precipitazione in etanolo. <ol class="lalpha"><li> Per un volume di reazione di 20 microlitri, aggiungere 115 ml di dH 2 O e 15 ml di acetato di sodio 3 M per la reazione. </li><li> Mescolare accuratamente, quindi aggiungere 75 ml di acido fenolo e 75 microlitri di cloroformio. Mescolare la soluzione con il vortex, poi microcentrifuga per un minuto a 13.000 giri al minuto a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e ripetere l&#39;estrazione </li><li> Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere 150 ml di cloroformio. Vortex il composto e centrifuga come prima. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. </li></ol></li><li> Recuperare l&#39;RNA con l&#39;aggiunta di due volumi del 100% di etanolo freddo per lo strato acquoso e mescolando bene. Freddo la miscela per un minimo di 15 minuti a -20 ° C quindi si centrifuga a 4 ° C per 15 minuti alla massima velocità per far sedimentare l&#39;RNA. Rimuovere con cura il supernatante e risospendere il pellet in 105 ml di 0.1x Tris-EDTA (TE) Buffer .. </li></ol></li><li> E &#39;difficile rimuovere tutti i nucleotidi liberi dalla reazione Kit T7, quindi per i risultati più accurati, quantificare l&#39;RNA utilizzando RiboGreen. <ol class="lalpha"><li> Per iniziare la quantificazione, in primo luogo diluire abbastanza 1x TE, 2.300 microlitri + 50μL/sample. </li><li> Quindi, rendere il RiboGreen. Avrete bisogno di 1000 ml + 50 microlitri / campione. Per i campioni di alta gamma (1 mg / ml a 20 ng / ml) mescolare il 1:200 RiboGreen in 1x TE, per i campioni di gamma bassa (50 ng / mL a 1 ng / ml) mescolare il 1:2000 RiboGreen in 1x TE ; Pipettare 50 ml di soluzione RiboGreen in ciascun pozzetto di una piastra opaca, a partire da A1 e in movimento verso il basso, e non tra </li><li> Diluire una soluzione madre di RNA a 2 mg / ml per i campioni di alta gamma o 100 ng / mL per i campioni gamma bassa </li><li> Utilizzando le soluzioni stock, creare una curva standard da sei successive diluizioni 1:02 dell&#39;originale 2 mg / ml o 100 ng / mL magazzino; Pipettare 240 l di stock in un tubo striscia di PCR. Nei restanti 7 tubi, pipetta 120 ml di TE 1x. Prendete 120 microlitri dal ceppo RNA bene, e mescolare con tubo 2. Prendete 120 microlitri da provetta 2 e miscelare con tubo 3. Ripetere l&#39;operazione fino tubo 7. Tubo 8 avrà solo TE e sarà il vostro vuoto. Pipettare 50 ml di soluzioni curva standard nella piastra opaca, A1: H2 (eseguire la curva due volte) </li><li> In un nuovo tubo, mescolare 45 ml di TE con 5 ml di piscina oligo e aggiungere tutti i 50 microlitri di un pozzo che contiene 50 ml di RiboGreen. </li><li> Utilizzando un lettore di piastre impostare la macchina per leggere la fluorescenza dall&#39;alto dopo un minuto di mescolare con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 485 nm e lunghezza d&#39;onda di emissione di 530 nm e leggere la piastra </li><li> Utilizzare la curva standard generato per quantificare l&#39;RNA recuperato, che devono essere conservati a -20 ° C. </li></ol></li></ol> Co-immunoprecipitazione della piscina oligo con un RNP di interesse <ol><li> Prima di iniziare la co-immunoprecipitazione, preparare la proteina A e proteina G Dynabeads da Invitrogen mescolando in un rapporto di 1:1 fino ad un volume finale di 50 microlitri per reazione. Ad esempio, per due reazioni si dovrebbe aggiungere 50 microlitri di ciascun ciascuna sfera. </li><li> Utilizzare un supporto magnetico di separazione come questo da Novagen per tenere le sfere in posizione mentre si rimuove il supernatante e lavare le perle due volte con un uguale volume di freddo 1x PBS </li><li> Dopo il secondo lavaggio, risospendere le sfere in un volume uguale di freddo 1x PBS e aggiungere 2 ng degli anticorpi per reazione. Tale importo può variare a seconda dell&#39;anticorpo, così la sperimentazione è necessario trovare le condizioni ottimali. </li><li> Incubare l&#39;anticorpo / tallone miscela notte a 4 ° C su una piattaforma rotante </li><li> Al mattino, aggiungere 2 mg per reazione di RNA totale sonicato lievito per bloccare legame non specifico, e ruotare per altri 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Utilizzando il sostegno magnetico per tenere le perline, rimuovere il supernatante e lavare le perle due volte con PBS freddo 1x, lasciando la PBS dal secondo lavaggio nel tubo. </li><li> Estrarre nuovi tubi, uno per ogni reazione e aliquota 50 microlitri della miscela tallone in ciascuna provetta. Lasciate le perline sedersi mentre si prepara una master mix </li><li> Per ogni reazione di aggiungere 200 ng del pool di oligo, un rapporto equimolare di primer di protezione, 2 mg di RNA totale sonicato lievito, 20 ml di estratto di HeLa nucleare (questa è la fonte RNP), ed E tampone per portare il volume fino a 120 microlitri. Il primer di protezione sono le versioni di RNA del primer universale. Modelli ordine trascrizione del primer universale con un tag T7 aggiunto alla fine, poi trascrivere RNA da i modelli utilizzando il kit MEGAshortscript ™. </li><li> Eliminare il surnatante dal aliquote tallone e perline risospendere in 120 microlitri della master mix. Rock the reazioni a 4 ° C per 1-2 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, per ogni reazione, rimuovere una piccola aliquota (tra cui le perle) per un campione &quot;totale&quot; RNA </li><li> Mettere il resto delle reazioni sulla separazione magnetica riposare e rimuovere il surnatante. Anche se non è necessario analizzare questo flow-through a valle del campione, può essere utile per salvare. </li><li> Lavare le perle 1-2 volte con 50 ml di freddo 1x PBS. L&#39;RNA legato l&#39;anticorpo sulle perle è il campione &quot;IP&quot;. </li><li> Risospendere il &quot;totale&quot; e la &quot;IP&quot; perle in 50 ml di 1% SDS a tampone 0,1 x TE e riscaldare i campioni a 65 ° C per 15 minuti per eluire l&#39;RNA. </li><li> Rimuovere il surnatante, che ora contiene l&#39;RNA che è stato precedentemente legato ai talloni e pulire per estrazione fenolo / cloroformio seguita da una precipitazione in etanolo. Asciugare il pellet e risospendere in 50 microlitri di buffer TE 0.1x. </li></ol> Trascrizione inversa e l&#39;amplificazione di co-IP campioni in preparazione per l&#39;etichettatura aminoallyl <ol><li> Successivamente, i campioni di RNA deve essere trascrizione inversa e PCR amplificato. Per la reazione di trascrizione inversa, utilizzare il primer reverse universale. </li><li> Per ogni campione, inizia mescolando 1 ml diil primer reverse universale, con 1 ml di modello di RNA (dalla reazione immunoprecipitazione) e 10 ml di dH 2 O. Calore le reazioni a 70 ° C per 5 minuti poi raffreddare sul ghiaccio o mantenere a 4 ° C. </li><li> Mentre i campioni raffreddare, portare il mix successivo master. Per ogni reazione di combinare 4 ml di 10 mM dNTPs, 2 ml di tampone 10x Arrayscript, 1 inibitore microlitri RNasi, enzimi e 1 microlitri trascrizione inversa. Mescolare bene e aggiungere 8 ml di mix master per ogni reazione di trascrizione inversa. </li><li> Utilizzare una macchina di PCR per incubare i campioni a 42 ° C per 2 ore, seguita da 95 ° C per 5 minuti, poi 4 ° C fino a quando i campioni sono necessari per l&#39;amplificazione. </li><li> Dopo la trascrizione inversa campioni di RNA, PCR li amplificano utilizzando il primer universale, con uno dei primer contenente un tag T7. Il numero di cicli necessari per amplificare la piscina dipende l&#39;efficienza del co-IP quindi potrebbe essere necessario provare più cicli. Ogni reazione richiede 5 ml di tampone di reazione 10X Taq, 0,2 ml di ogni primer (100 mm), 1 l di modello di cDNA (dalla reazione di trascrizione inversa), 1 ml di 10 mM dNTPs, 42,2 ml di dH 2 O, e 0,4 l di enzima Taq. Iniziare la PCR incubando i campioni a 94 ° C per 3 minuti. Successivamente, per ogni ciclo di snaturare, a 94 ° C per 45 secondi, annealing a 55 ° C per 30 secondi, e allungare a 72 ° C per un minuto, con un allungamento finale a 72 ° C per 10 minuti. </li><li> Successivamente, trascrivere i campioni di nuovo utilizzando il kit MEGAshortscript ™, però, questa volta aggiungere 2 l di aminoallyl UTP, al posto del UTP T7. L&#39;UTP aminoallyl saranno utilizzati per etichettare l&#39;RNA con i coloranti Cy. </li><li> Fenolo / cloroformio ed etanolo precipitare i campioni. NON utilizzare Glycoblue o acetato di ammonio, entrambi i quali possono interferire con l&#39;ibridazione dei campioni alla matrice. Asciugare il pellet e risospendere in 4,5 l di carbonato di sodio 0,1 M. </li></ol> Amino-allil etichettatura di RNA con coloranti Cy <ol><li> Per iniziare il protocollo di etichettatura sciogliere ciascuna delle tinture fluorescenti, Cy3 e Cy5, in 45 ml di DMSO. Per evitare la luce, avvolgere i tubi in foglio di alluminio e conservare a -20 ° C al buio </li><li> Aggiungere 2,5 l di acqua priva di nucleasi a RNA campioni e mescolare accuratamente </li><li> Successivamente, aggiungere 3 ml di Cy3 al campione &quot;totale&quot;, e 3 ml di Cy5 al campione &quot;IP&quot;. Incubare i campioni al buio per 1 ora a temperatura ambiente; Il Cy-3 del campione diventa rosso o rosa, mentre il Cy-5 diventerà blu. </li><li> Per terminare la reazione, aggiungere 6 uL di 4 M idrossilammina-HCl per ogni campione, mescolare bene e far girare brevemente. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Purificare i campioni etichettati per estrazione fenolo / cloroformio seguita da etanolo precipitazioni e risospendere pellet in 50 ml di 0,1 x TE </li></ol> Ibridare i campioni del microarray utilizzando il kit Array Agilent ibridazione <ol><li> Iniziare l&#39;ibridazione con delicatezza mescolando 50 ml di tampone di bloccaggio 10x, 140 ml di nucleasi-free H2 O, 25 microlitri della Cy3 marcato piscina &quot;totale&quot;, 25 microlitri della piscina-Cy5 etichettato &quot;IP&quot;, 10 microlitri della frammentazione tampone 25x e 250 ml di buffer di ibridazione 2x, avendo cura di evitare l&#39;introduzione di bolle. Microcentrifuga il campione leggermente per raccogliere la soluzione sul fondo del tubo e anche per ridurre le bolle. </li><li> Posizionare l&#39;O-ring far scivolare il coperchio della camera di ibridazione e con attenzione pipetta la soluzione sul vetrino. </li><li> Posizionare la matrice di rilevamento sulla parte superiore della diapositiva copertura a &quot;sandwich&quot; la soluzione. Ricordate di orientare la diapositiva array in modo che l&#39;etichetta Agilent sulla matrice volti l&#39;etichetta Agilent sul vetrino di copertura. </li><li> Morsetto della diapositiva / array panino nella camera di ibridazione e ruotare a 50 ° C per 3 ore. </li><li> Mentre la serie è rotante, effettuare le seguenti soluzioni di 50 mL in provette coniche da 50 ml: una conica riempita con 50 ml di dH 2 O, due 1x SCC soluzioni tampone, ciascuno in un tubo separato, e un buffer di 2x SCC. </li><li> Dopo le tre ore di incubazione, con attenzione sbloccaggio l&#39;array / slide panino e mettetelo nel 50 ml conica contenente il tampone 2x SCC. Utilizzando un paio di pinzette, separare delicatamente l&#39;array dalla diapositiva copertura ed estrarre il vetrino di copertura. Fare attenzione a non toccare l&#39;array come la diapositiva è tirato fuori. Chiudere il conica e capovolgere delicatamente per 60 secondi. </li><li> Con le pinze, la matrice di trasferimento alla soluzione 1x SCC, tappare la provetta, e capovolgere delicatamente per 1 minuto poi trasferire l&#39;array per la seconda soluzione 1x SCC e ancora capovolgere delicatamente per un altro minuto. </li><li> Infine, la matrice di trasferimento al tubo di dH 2 O e capovolgere delicatamente per 30 secondi. </li><li> Secco l&#39;array ponendo il bordo del vetrino su un Kimwipe. Continuare a ruotare l&#39;array sul pulire facendo attenzione a non disturbare il lato contenente le oligo. </li><li> Posizionare l&#39;array a secco inuna vuota da 50 ml tubo conico e scansione con uno scanner Microarray </li></ol> Interpretazione dei Microarray <ol><li> Lo scanner microarray creerà una immagine TIF dell&#39;array. Eseguire questa immagine attraverso il software di Agilent Feature Extraction, utilizzando il file della griglia (fornito da Agilent) che è unico alla tua riserva specifica. </li><li> Il software Agilent interpreterà il segnale in ogni funzione per creare un file, che viene analizzato con uno script Perl. Il segnale ad ogni funzione è di normalizzare l&#39;intensità totale in quel canale. Per esempio a una caratteristica particolare nel canale verde, l&#39;intensità del canale verde per la funzione individuale è divisa per l&#39;intensità totale del canale verde su tutte le caratteristiche. Il risultato finale è il rapporto log del canale rosso sul canale verde a ciascuna funzione sulla matrice. </li><li> I dati piscina oligo dal microarray può essere ri-mappata nuovo al genoma per ottenere un quadro di dove e come fortemente, la RNP di interesse legato. </li></ol> Figura 1. Schema sperimentale <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /> A. Piastrelle schema. Dopo aver selezionato e il download di pre-mRNA sequenze di interesse, l&#39;area scelta è piastrellato con finestre in 30 nucleotidi che cambiano con incrementi di 10 nucleotidi. Universale fianco primer siti ogni lato della finestra. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="Figura 1b" /> B. Sintesi di array. Piastrelle ordini oligo devono essere presentate alla Agilent, dove le sequenze verrà stampato su un oligonucleotide microarray su ordinazione. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="Figura 1c" /> C. Co-immunoprecipitazione. Dopo aver fatto bollire l&#39;oligo fuori dell&#39;array, incubare in estratto HeLa nucleare, quindi aggiungere l&#39;estratto di sfere magnetiche che vengono preparati con un anticorpo contro la RNP di interesse. Etichetta la piscina oligo partire Cy3 e la piscina legato IP con Cy5 e applicare alla matrice di rilevamento e scansione. Figura 2. L&#39;annotazione del genoma e con l&#39;analisi dei dati di arricchimento. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="Figura 2" /> A. Convertire il punteggio medio di ogni coordinata dai dati genomici array di base-ten log e mappa che punteggio alle coordinate date. Un esempio di questo passo media viene somministrato per 3 sovrapposizione di 30 nt oligo con i punteggi di 2, 4 e 0,5, in cui viene rappresentata graficamente il punteggio di arricchimento medio per ogni 10-nt finestra sopra. Le regioni genomiche selezionato può essere visualizzato usando una traccia personalizzati nel Browser Genome USCS. La finestra del browser esempio dato è nel gene clta, dove sono riportate le caratteristiche gene (esoni / introni / splicing alternativo, ecc) lungo la parte inferiore e punteggi arricchimento log media dal PTB-bound oligo sono rappresentate da barre rosse verticali scure. PTB si lega fortemente a monte dell&#39;esone 2 nel tratto polypyrimidine.

Quando si esegue questa procedura il suo importante ricordare che la creazione della piscina è flessibile e aperto a modifiche sia a livello del RNA o proteine. A livello di RNA regioni ortologhi, le mutazioni malattia, polimorfismi o mutazioni casuali possono essere introdotti nella sequenza di oligonucleotidi. A livello della proteina del fattore di RNA binding può essere modificata o modifiche fosforilazione altro post traduzionali. Inoltre, l&#39;ambiente vincolante possono essere manipolati per aumentare o diminu...

a rapid high-throughput method for mapping ribonucleoproteins (rnps) on human pre-mrna

Sequenziamento RNA che la co-immunoprecipitato (co-IP) con le proteine ​​RNA binding ha aumentato la nostra comprensione di splicing, dimostrando che ubicazione vincolante spesso influenza la funzione di un fattore di splicing. Tuttavia, come con qualsiasi strategia di campionamento la possibilità di individuare un RNA legato a un fattore di splicing è proporzionale alla sua abbondanza cellulare. Abbiamo sviluppato un nuovo approccio in vitro per la rilevazione sulle specificità di legame altrimenti transitorio pre-mRNA. Questo approccio utilizza una piscina appositamente progettato oligonucleotide che le piastrelle in introni, esoni, giunzioni di splicing, o altre pre-mRNA. La piscina è sottoposto a una sorta di selezione molecolare. Qui, noi dimostrare il metodo separando la oligonucleotidi in una frazione legati e non legati e utilizzare una strategia a due serie a colori per registrare l&#39;arricchimento di ogni oligonucleotide nella frazione legata. I dati di matrice genera mappe ad alta risoluzione con la capacità di identificare la sequenza-specifica e strutturale determina di ribonucleoproteina (RNP) vincolanti per pre-mRNA. Un vantaggio unico di questo metodo è la sua capacità di evitare il bias di campionamento verso mRNA associati con IP corrente e le tecniche di SELEX, come la piscina è appositamente progettata e sintetizzata dal pre-mRNA sequenza. La flessibilità della piscina oligonucleotide è un altro vantaggio in quanto lo sperimentatore sceglie quali le regioni di studiare e piastrelle in tutto, adattando la piscina alle loro esigenze individuali. Utilizzando questa tecnica, si può dosaggio gli effetti di polimorfismi o mutazioni su vincolante su larga scala o clonare la libreria in un reporter splicing funzionale e identificare oligonucleotidi che si arricchisce nella frazione incluso. Questo romanzo in vitro ad alta risoluzione schema di mappatura fornisce un modo unico per studiare le interazioni RNP con transitorio pre-mRNA specie, la cui bassa abbondanza li rende difficili da studiare con le attuali tecniche in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA at JoVE.com

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e studiare<em&gt; In vivo</em&gt;. Qui, vi presentiamo un romanzo<em&gt; In vitro</emApproccio&gt; per indagare le interazioni RNA-proteina con un pool di sintesi oligo che le piastrelle in regioni selezionate del pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

a-rapid-high-throughput-method-for-mapping-ribonucleoproteins-rnps-on

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

11.7K Views.  Brown University. A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e studiare In vivo. Qui, vi presentiamo un romanzo In vitro per indagare le interazioni RNA-proteina con un pool di sintesi oligo che le piastrelle in regioni selezionate del pre-mRNA.

Video: A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Ricerca

Genetica

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochimica

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Biologia dello sviluppo

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Biologia

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded cellular environment. Ribosomes provide the platform for spatially and kinetically controlled binding of membrane-targeting factors, modifying enzymes, and folding chaperones. Even the assembly into high-order oligomeric complexes, as well as protein-protein network formation steps, were recently discovered to be coordinated with synthesis.
Here, we describe Selective Ribosome Profiling, a method developed to capture co-translational interactions in vivo. We will detail the various affinity purification steps required for capturing ribosome-nascent-chain complexes together with co-translational interactors, as well as the mRNA extraction, size exclusion, reverse transcription, deep-sequencing, and big-data analysis steps, required to decipher co-translational interactions in near-codon resolution.

Co-translational interactions play a crucial role in nascent-chain modifications, targeting, folding, and assembly pathways. Here, we describe Selective Ribosome Profiling, a method for in vivo, direct analysis of these interactions in the model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Identificazione globale delle reti di interazione co-traslazionale mediante profilazione selettiva dei ribosomi

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Novel RNA-Proteine leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

Metodo per l'isolamento e l'identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

Identificazione globale delle reti di interazione co-traslazionale mediante profilazione selettiva dei ribosomi

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

Metodo per l'isolamento e l'identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

Identificazione globale delle reti di interazione co-traslazionale mediante profilazione selettiva dei ribosomi

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Novel RNA-Proteine leganti isolamento dalla rapida Metodologia