Ringraziamo Anthony J. Koleske, PhD per fornire i topi YFP.

Parte 1: Ottica microprismi e l&#39;installazione Microscopio <ol><li> Il microprismi da noi utilizzati sono di 1 mm, ad angolo retto prismi a base di vetro BK7 acquistati dal Optosigma Corporation (Figura 1). Microprismi sono trattati con pinze quando possibile. </li><li> L&#39;ipotenusa del microprismi è rivestita con argento migliorato per fornire una riflettività superiore al 97% 400-2000 nm. Ciò fornisce riflessione interna sia la luce laser di eccitazione e la fluorescenza emessa. </li><li> Microprismi sono sempre trattati con pinze quando possibile. I guanti sono indossati in ogni momento a tenere pulito il prisma. </li><li> Usiamo un custom-built microscopio a due fotoni in grado di piccoli animali di imaging. L&#39;animale, collegare al dispositivo stereotassica, è posto su un palco a 3 assi motorizzati. </li><li> Il microscopio è collegato ad un PC Windows in esecuzione il software scanimage. Scanimage è software di acquisizione immagini scritto in Matlab da Pologruto et al 1. </li><li> Per l&#39;imaging microprismi, raccogliamo le immagini con una risoluzione di 1024 x 1024 o 512 x 512 pixel. Inoltre, di solito la scansione a 2 ms / riga o 4 ms / linea. </li><li> Due tipi di obiettivi sono utilizzati negli esperimenti: <ul><li> Una minore apertura numerica (NA) obiettivo aria per ampio campo di vista per immagini (vedi Tabella di reagenti e macchinari). </li><li> Un obiettivo più alto d&#39;aria NA con un collare di correzione di vetro in grado di minimizzare le aberrazioni sferiche indotta da 0 - 2 mm di vetro (vedi Tabella di reagenti e macchinari). </li></ul></li><li> Quando l&#39;animale è pronto per l&#39;imaging con un obiettivo a basso ingrandimento, allineare il modello quadrato raster di scansione del laser con la parte superiore del microprismi. Questo aiuterà l&#39;immagine orientarsi e fare un uso efficiente della potenza del laser. </li><li> Utilizzando un obiettivo più alto NA con un collare di correzione di vetro, impostare il collare di correzione per correggere circa 1 mm di vetro. Una volta che l&#39;immagine fluorescente viene visualizzata durante l&#39;esperimento, si può raggiungere con cura all&#39;interno del microscopio per ottimizzare il collare di correzione per ottimizzare la risoluzione delle immagini. </li></ol> Parte 2: non la sopravvivenza degli animali e Chirurgia inserzione microprismi <ol><li> La lunghezza intera procedura, dalla incisione iniziale fino al completamento di imaging, dipende dagli obiettivi dell&#39;esperimento. Tuttavia, la disposizione non sopravvivenza procedura chirurgica e microprismi si può aspettare che richiede circa 30 - 40 minuti per essere completato. </li><li> Topi (P30-P60) vengono pesati e anestetizzati con una iniezione opportunamente IP di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) a un piano adatto per interventi chirurgici. </li><li> Per tutto l&#39;intero esperimento, l&#39;animale deve essere controllato ogni 15-20 minuti per valutare il livello di anestesia. Se l&#39;animale reagisce a una ditta di convergenza pizzico, una dose supplementare di ketamina / xylazina è richiesto. In genere una dose supplementare è un terzo della dose iniziale e può essere preparata in anticipo in una siringa per l&#39;immediata iniezione IP, se necessario. </li><li> Una volta che il mouse viene adeguatamente anestetizzato, la maggior parte dei capelli sulla testa dell&#39;animale è radere utilizzando un decespugliatore con lama # 40. </li><li> Nair ® è applicato al peli rimasti sulla testa per creare una superficie libera di peli che possono ottenere nel senso della microprismi durante imaging. Dopo 5 minuti, la Nair ® è rimosso con un tampone di cotone con punta. </li><li> L&#39;animale anestetizzato è correttamente inserito in un dispositivo stereotassico mouse. Durante le procedure chirurgiche e le sessioni di imaging l&#39;animale è mantenuto su un pieno d&#39;acqua, piastra elettrica fissato a 36 gradi Celsius. </li><li> Con la testa dell&#39;animale correttamente fissata al suo posto, una incisione pulito è effettuata utilizzando un bisturi lungo la linea mediana del cranio per separare la pelle. </li><li> Una piccola quantità di perossido di idrogeno al 3% è collocato su un batuffolo di cotone con punta e applicata al cranio per eliminare le membrane tra il cranio e la pelle. </li><li> Il perossido di idrogeno aiuta anche a svelare bregma, un punto di riferimento importante nel sapere dove eseguire la craniotomia e inserire il microprismi. </li><li> Prima che la craniotomia è avviato, il bar e il bar morso all&#39;orecchio siano regolate correttamente per inclinare il cranio esposti in modo tale che è fondamentalmente il livello con la tabella. Ciò fornisce una piattaforma migliore per la craniotomia. Inoltre, questo rende la superficie superiore della perpendicolare prisma con la luce di eccitazione in arrivo. Questo contribuirà a minimizzare le aberrazioni ottiche, mentre imaging. </li><li> Una piccola bava dentale (~ 0.8 dimensioni della testa mm) è collegato ad uno strumento di Dremel ® utilizzando un braccio flessibile estensione. Per craniotomie, abbiamo impostato la velocità a circa 7.000 a 10.000 giri. </li><li> La bava dentale è scremato lungo il cranio fino a quando un solco quadrato è stabilita nelle ossa. I lati della piazza sono circa 2-3 mm di lunghezza e 1,5 centrato caudale mm e 1 mm lateralmente al bregma. </li><li> Proseguendo assottigliamento dell&#39;osso fino a una piccola apertura è fatta attraverso il cranio. Un paio di pinze can sollevare il lembo osseo lontano dal cranio. </li><li> La durata deve essere rimosso prima che il microprismi può essere inserito nella corteccia. Il sanguinamento è controllato meglio lasciando coagulare il sangue in superficie per alcuni minuti. Successivamente, il sangue coagulato viene rimosso con una spugna chirurgica prima di inserire la microprismi. </li><li> Per aiutare aiutare l&#39;allineamento del prisma con la corteccia, la faccia verticale del microprismi è allineata parallelamente alle maniglie del forcipe. </li><li> Con il prisma correttamente affermato, la microprismi tutto viene inserito fino a quando la parte superiore del prisma è a filo con la superficie neocorticale. </li><li> Una volta inserito correttamente, il microprismi dovrebbe rimanere nella posizione corretta. Qualsiasi sanguinamento che ne deriva è minimo e può essere assorbito con una piccola spugna chirurgica. Una volta che il prisma è al suo posto l&#39;animale è pronto per l&#39;imaging. </li><li> Dopo un microprismi è stato utilizzato in un animale, può essere riutilizzato più volte. Tuttavia, ha bisogno di essere puliti per rimuovere tutto il materiale residuo biologico. Questo può essere ottenuto immergendo il prisma in un piccolo volume di HCl acido, seguita da un tuffo in metanolo. Il microprismi pulite possono poi essere avvolti in carta per lenti fino al momento dell&#39;uso futuro. </li></ol> Parte 3: Risultati Rappresentante <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Immagini del angolo retto microprismi. Prismi utilizzati in questo esperimento sono un millimetro, prismi di vetro BK7 con un rivestimento in argento rafforzata sulla ipotenusa per consentire riflessione interna di eccitazione e di emissione di luce. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Immagine dello strato V YFP neuroni piramidali. Ampio campo di vista di imaging con i microprismi rivela una vasta popolazione di corpi cellulari piramidali ~ 800-900 micron in profondità dalla superficie corticale. Inoltre, dendriti apicali che si estende fino alla strato posso anche essere risolto. Barra di scala = 200 micron. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Un obiettivo apertura superiore numerico utilizzato in combinazione con il microprismi offre risoluzione spaziale sufficiente a risolvere spine dendritiche sui dendriti apicali sul livello V neuroni piramidali. Barra di scala = 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: L&#39;immagine ottenuta utilizzando il microprismi e una coda-vena iniezione di colorante fluorescente. L&#39;immagine mostra verticale, vasi di grosso calibro che si estende da regioni cerebrali profonde e più piccoli capillari che si diramano attraverso il volume corticale. Barra di scala = 200 micron. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Utilizzo di un obiettivo più alto apertura numerica, la rete di capillari nella neocorteccia può essere ripreso con maggiore dettaglio. Barra di scala = 50 micron. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: microprismi consente anche per l&#39;imaging globuli rossi (RBC) che scorre attraverso i vasi. Globuli rossi non assorbono il colorante fluorescente e quindi sono viste come strisce scure che attraversano la nave. Con la scansione lineare attraverso il vaso, si può ottenere misurazioni del flusso dei globuli rossi e velocità. Barra di scala = 10 micron (barra orizzontale di immagine superiore e inferiore) e 250 ms (barra verticale in immagine in basso).

<ol>
	<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal IACUC della Yale University.

Utilizzando un microprismi in un esperimento di imaging è relativamente semplice e offre molti vantaggi per studi in vivo sul neocorteccia. Esempi rappresentativi di questa tecnica includono immagini tratte da topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla nello strato V neuroni corticali. Utilizzando microprismi si può vedere una collezione di grandi corpi cellulari piramidali dello strato V, quasi 1 mm sotto la superficie corticale. Visto anche i dendriti apicali che si estendono attraverso tutti gli...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td>
<td>055-0010</td>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein-dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>FD70</td>
<td>70 kDa </td>
</tr>
<tr>
<td>0.28 NA, 4x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>XLFLUOR 4x/340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.60 NA, 40x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>LUCPLFLN</td>
<td>With 0-2 mm coverglass correction</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging of deep cortical layers using a microprism

Vi presentiamo un protocollo per l&#39;imaging in vivo di tessuto corticale utilizzando una profonda sonda di imaging del cervello in forma di microprismi. Microprismi sono 1-mm e hanno un rivestimento riflettente l&#39;ipotenusa per consentire riflessione interna di eccitazione e di emissione di luce. La sonda microprismi contemporaneamente più immagini strati corticali con una prospettiva tipicamente visto solo in preparati fetta. Le immagini sono raccolte in un grande campo di vista (~ 900 micron). Inoltre, forniamo i dettagli sulla non-sopravvivenza procedura chirurgica e la configurazione microscopio. Risultati rappresentativi includono immagini dello strato V neuroni piramidali da Thy-1-H YFP topi mostrano il loro dendriti apicali si estende attraverso lo strato superficiale della corteccia e si estende in ciuffi. Risoluzione è stata sufficiente a immagine spine dendritiche nei pressi del soma di strato di neuroni V. Una coda vena iniezione di colorante fluorescente svela l&#39;intricata rete di vasi sanguigni nella corteccia. Scansione lineare di globuli rossi (RBC) che fluisce attraverso i capillari rivela la velocità dei globuli rossi e tassi di flusso possono essere ottenuti. Questa sonda microprismi romanzo è un elegante metodo nuovo e potente di visualizzare profonde strutture cellulari e la funzione corticale in vivo.

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In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Angolo retto microprismi inserita nella neocorteccia del mouse permette l&#39;imaging con profonda di più strati corticali con un punto di vista tipicamente si trovano in fetta. Un millimetro microprismi offrono un ampio campo di vista (~ 900 micron) e risoluzione spaziale sufficiente per risolvere spine dendritiche. Dimostriamo strato di imaging neuronale V e neocorticale imaging vascolare con microprismi.

Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

11.3K Views.  Yale University. Angolo retto microprismi inserita nella neocorteccia del mouse permette l'imaging con profonda di più strati corticali con un punto di vista tipicamente si trovano in fetta. Un millimetro microprismi offrono un ampio campo di vista (~ 900 micron) e risoluzione spaziale sufficiente per risolvere spine dendritiche. Dimostriamo strato di imaging neuronale V e neocorticale imaging vascolare con microprismi.

Video: In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparazione del dissociato Culture Neuron mouse corticale

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Ricerca

Biologia

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

Imaging di calcio di neuroni corticali usando Fura-02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent Imaging dei tumori mammari che usano lo spettro IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Singola molecola di imaging del regolamento Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

La quantificazione di espressione della proteina e co-localizzazione Usando multiplex immunoistochimica di colorazione e multispettrale Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

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