אנו מודים אנתוני ג&#39;יי Koleske, PhD למתן העכברים YFP.

חלק 1: אופטיקה Microprism ותוכנית ההתקנה מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microprisms אנו משתמשים הינם 1 מ&quot;מ, בזווית ישרה מנסרות מזכוכית BK7 לרכוש חברת Optosigma (איור 1). Microprisms מטופלות באמצעות מלקחיים במידת האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היתר של microprism מצופה כסף משופרת לספק רפלקטיביות של 97% יותר מאשר 400-2000 ננומטר. זה מספק התבוננות פנימית של שני אור לייזר עירור לבין הקרינה הנפלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microprisms מטופלות תמיד באמצעות מלקחיים כאשר הדבר אפשרי. כפפות שחוקים בכל עת כדי לשמור על הפריזמה נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים שהותקן שני פוטונים המיקרוסקופ מסוגל הדמיה של חיות קטנות. בעלי חיים, המחובר למכשיר stereotactic, ממוקם על הבמה 3-ציר ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיקרוסקופ מחובר למחשב Windows רץ תוכנה ScanImage. ScanImage היא רכישת תמונה תוכנה נכתב על ידי Matlab Pologruto ואח&#39; 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה microprism, אנו אוספים תמונות ברזולוציה של 1024 x 1024 או 512 x 512 פיקסלים. בנוסף, אנו בדרך כלל סריקה בבית 2 ms / או קו 4 ms / קו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני סוגים של מטרות משמשים בניסויים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמצם נמוך מספרית (NA) אוויר אובייקטיבי הדמיה בתחום רחב של נוף (ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NA גבוה אובייקטיבי אוויר עם צווארון זכוכית תיקון מסוגל מזעור סטיות המושרה על ידי כדורי 0-2 מ&quot;מ זכוכית (ר &#39;טבלה של חומרים כימיים וציוד). </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר החיה מוכן הדמיה תחת מטרה בהגדלה נמוכה, ליישר את דפוס raster מרובע סריקה של הלייזר עם החלק העליון של microprism. זה יעזור לכוון את התמונה ולעשות שימוש יעיל של כוח לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש גבוה יותר אובייקטיבי NA עם צווארון תיקון זכוכית, להגדיר את צווארון תיקון לתקן כ 1 מ&quot;מ זכוכית. לאחר תמונה פלורסנט מופיע במהלך הניסוי, אפשר להגיע בזהירות בתוך מיקרוסקופ כדי לייעל את צווארון תיקון על מנת למקסם את רזולוציית הדמיה. </li></ol> חלק 2: Non-הישרדות כירורגיה בעלי חיים הכנסת Microprism <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משך ההליך כולו, מן החתך הראשוני עד לסיום הדמיה, תלוי את מטרות הניסוי. עם זאת, המיקום הלא הישרדות microprism הליך כירורגי וניתן לצפות לקחת כ 30-40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים (P30-P60) הם שקלו כראוי בהרדמה באמצעות זריקה IP של קטמין (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) למישור מתאים ניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הניסוי כולו, החיה יש לבדוק כל 15-20 דקות כדי להעריך את רמתו של הרדמה. אם החיה מגיבה חברת הבוהן קמצוץ, מנה של קטמין משלים / xylazine נדרשת. בדרך כלל מנה משלים הוא שליש המינון הראשוני יכול להיות מוכן מראש של מזרק להזרקה IP מיידי במקרה הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא הרדים כראוי, הרוב של השיער על הראש של החיה הוא גילח באמצעות גוזם עם להב # 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נאיר ® מוחל על השערות שנותרו על ראשו כדי לסייע ליצור משטח ללא שערות שעלולות להפריע של microprism במהלך ההדמיה. אחרי 5 דקות, ® נאיר הוא ניקה באמצעות מטלית כותנה שקצהו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיה הרדים ממוקם כראוי לתוך מכשיר stereotactic העכבר. במהלך ניתוחים הפעלות הדמיה חיה נשמר על כרית חימום מים מלאים נקבע על 36 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ראש של חיה קבוע כראוי במקום אחד חתך נקי נעשית באמצעות אזמל לאורך הקו המדיאלי של הגולגולת כדי להפריד את העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות קטנה של מי חמצן 3% מושם על כותנה שקצהו ספוגית ותוחל הגולגולת כדי לנקות את הקרומים שבין הגולגולת לבין העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מי חמצן גם עוזר לחשוף גבחת, ציון דרך חשוב לדעת היכן לבצע את craniotomy והכנס את microprism. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני craniotomy הוא התחיל, ברים האוזן בר לנשוך מותאמים כהלכה כדי להטות את הגולגולת חשוף כזה שזה בעצם רמה עם השולחן. זה מספק פלטפורמה טובה יותר עבור craniotomy. בנוסף, זה הופך את המשטח העליון של הניצב פריזמה עם האור עירור נכנסות. זה יעזור למזער סטיות אופטיות תוך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בר שיניים קטן (~ 0.8 ראש בגודל מ&quot;מ) מחוברת לכלי Dremel ® באמצעות זרוע הארכה גמיש. עבור craniotomies, אנו קובעים את המהירות לכ 7,000 ל -10,000 rpms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בר שיניים הוא רזה לאורך הגולגולת עד חריץ הכיכר הוקמה בשנת העצם. הצדדים של הכיכר כ 2-3 מ&quot;מ אורך ו 1.5 במרכז הזנב מ&quot;מ 1 מ&quot;מ לרוחב גבחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דילול העצם עד פתח קטן הוא עשה דרך הגולגולת. זוג מלקחיים can להרים את דש עצם מן הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דורה יש להסיר לפני microprism יכול להיות מוכנס לתוך קליפת המוח. דימום נשלטת על ידי מיטב לתת לדם להקריש על פני השטח במשך מספר דקות. לאחר מכן, בדם קרוש מוסר באמצעות ספוג כירורגית לפני הכנסת microprism. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעזור לסייע ביישור של פריזמה עם קליפה, פנים האנכי של microprism היא בשורה במקביל מטפל על מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פריזמה החזיקו כראוי, microprism כולו מוכנס עד החלק העליון של פריזמה הוא מיושר עם משטח neocortical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכנס בצורה נכונה, microprism צריך להישאר במצב הנכון. כל דימום כי התוצאות הוא מינימלי יכול להיספג עם ספוג כירורגי קטן. לאחר פריזמה נמצאת במקום החיה מוכן הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר microprism נעשה שימוש בבעלי חיים, זה יכול להיות שימוש חוזר מספר פעמים. לעומת זאת, יש לנקות היטב כדי להסיר כל חומר ביולוגי הנותרים. ניתן להשיג זאת על ידי טבילה פריזמה לתוך נפח קטן של חומצה HCl, ואחריו טבילה לתוך מתנול. Microprism לנקות אז יכול להיות עטוף בנייר העדשה עד לשימוש עתידי. </li></ol> חלק 3: תוצאות נציג <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: תמונות של microprism ימנית זווית. פריזמות השתמשו בניסוי הזה הם אחד מילימטר, מנסרות BK7 זכוכית עם ציפוי כסף משופרת על היתר כדי לאפשר התבוננות פנימית של עירור אור פליטה. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: תמונה של שכבה V נוירונים YFP פירמידה. הדמיה בתחום רחב של נוף עם microprism מגלה אוכלוסיה גדולה של גופי התא פירמידה ~ 800-900 מיקרומטר עמוק מפני השטח של קליפת המוח. בנוסף, דנדריטים apical הארכת לכיוון שכבת אני גם יכול להיפתר. בר סולם = 200 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3: המטרה הצמצם המספרי גבוה בשילוב עם microprism מספק רזולוציה מרחבית מספיק כדי לפתור הקוצים הדנדריטים על דנדריטים apical הנוירונים בשכבה V פירמידה. בר סולם = 10 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4: תמונה שהושגו באמצעות microprism וגם זנב זריקה לווריד של צבע פלואורסצנטי. התמונה מראה אנכית, כלי קליבר גדול המשתרעת באזורי מוח עמוקים נימים קטנים הסתעפות דרך בנפח קליפת המוח. בר סולם = 200 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5: שימוש מטרה גבוהה יותר הצמצם מספרית, רשת של נימים בתוך הניאוקורטקס ניתן הדמיה עם בפירוט רב יותר. בר סולם = 50 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6: Microprisms גם מאפשר הדמיה תאים דם אדומים (RBCs) זורם דרך כלי. RBCs לא לספוג את צבע פלואורסצנטי ולכן נתפסים פסים כהים על פני כלי השיט. על ידי סריקה קו לרוחב הכלי, ניתן להשיג מדידות של שטף RBC ומהירות. בר סולם = 10 מיקרומטר (הפס האופקי בתמונה למעלה ולמטה) ו 250 ms (סרגל אנכי בתמונה למטה).

<ol>
	<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי IACUC באוניברסיטת ייל.

שימוש microprism בניסוי הדמיה היא פשוטה יחסית, מציע יתרונות רבים עבור במחקרים vivo על הניאוקורטקס. דוגמאות מייצגות באמצעות טכניקה זו כוללת תמונות שצולמו מן העכברים הטרנסגניים לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב נוירונים בקליפת המוח שכבה V. שימוש microprisms ניתן לראות אוסף גדול של גופי...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td>
<td>055-0010</td>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein-dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>FD70</td>
<td>70 kDa </td>
</tr>
<tr>
<td>0.28 NA, 4x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>XLFLUOR 4x/340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.60 NA, 40x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>LUCPLFLN</td>
<td>With 0-2 mm coverglass correction</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging of deep cortical layers using a microprism

אנו מציגים פרוטוקול בתחום ההדמיה vivo של רקמת קליפת המוח באמצעות בדיקה עמוק במוח הדמיה בצורת microprism. Microprisms הם 1 מ&quot;מ בגודל יש ציפוי רפלקטיבי על היתר כדי לאפשר התבוננות פנימית של עירור אור פליטה. החללית microprism בו זמנית מספר רב של תמונות שכבות בקליפת המוח עם פרספקטיבה לראות בדרך כלל רק בהכנות פרוסה. תמונות נאספים עם גדול בתחום של נוף (~ 900 מיקרומטר). בנוסף, אנו מספקים פרטים על הליך בלתי הישרדות כירורגית ההתקנה מיקרוסקופ. תוצאות נציג לכלול תמונות של הנוירונים בשכבה V פירמידה מ Thy-1-H YFP בעכברים מראה דנדריטים apical שלהם הרחבת דרך שכבת קליפת המוח שטחית הרחבת לתוך הציציות. החלטה היה די כדי הדנדריטים התמונה קוצים ליד סומה של הנוירונים בשכבה V. הזרקה לווריד הזנב של צבע פלואורסצנטי חושף רשת סבוכה של כלי הדם בקליפת המוח. קו סריקה של כדוריות דם אדומות (RBCs) זורם דרך הנימים מגלה מהירות RBC ושיעורי השטף ניתן להשיג. זו בדיקה חדשנית microprism היא שיטה אלגנטית, חדשה וחזקה עדיין חזותי של מבנים הסלולר עמוק פונקציה קליפת המוח in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism at JoVE.com

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

ימנית זווית microprisms מוכנס לתוך הניאוקורטקס העכבר מאפשר הדמיה עמוק של שכבות מרובות קליפת המוח עם מבט נמצא בדרך כלל פרוסה. אחת מילימטר microprisms מציעים בתחום של נוף רחב (~ 900 מיקרומטר) והחלטות מרחבי מספיק כדי לפתור את הקוצים הדנדריטים. אנו מדגימים שכבה V הדמיה עצבית הדמיה של כלי הדם neocortical באמצעות microprisms.

בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

in-vivo-imaging-of-deep-cortical-layers-using-a-microprism

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

11.3K Views.  Yale University. ימנית זווית microprisms מוכנס לתוך הניאוקורטקס העכבר מאפשר הדמיה עמוק של שכבות מרובות קליפת המוח עם מבט נמצא בדרך כלל פרוסה. אחת מילימטר microprisms מציעים בתחום של נוף רחב (~ 900 מיקרומטר) והחלטות מרחבי מספיק כדי לפתור את הקוצים הדנדריטים. אנו מדגימים שכבה V הדמיה עצבית הדמי?...

Video: In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

סידן הדמיה של נוירונים קליפתיים באמצעות Fura, 02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

בשנת vivo Bioluminescent הדמיה של גידולים החלב באמצעות ספקטרום IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות Microprism

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video