Questo lavoro è stato sostenuto dal US Department of Defense (BC075554 di BG e BC061403 a DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 a JVR; CA100324 di JC, JES e JW; CA77522 di JES, U54CA126511 di JC e BG). Ringraziamo D. Entenberg aiuto per microscopia, M. Rottenkolber aiuto nella fabbricazione della scatola di imaging e J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) per l&#39;anticorpo F4/80.

1. Generazione di tumori fluorescenti con iniezione di cellule tumorali nel tappetino mammaria grasso: <ol><li> Crescere una linea cellulare che esprime Dendra2 proteine ​​(come marcatore citoplasmatica) al 40 - 80% confluenza. </li><li> Lavare i piatti almeno 3 volte con PBS w / o Ca 2 + o Mg 2 +. </li><li> Aggiungere 3 ml di tripsina per 10 piatti cm e incubare a 37 ° C fino a quando la maggior parte delle cellule staccare e poi ha colpito il piatto contro una superficie piana per scuoterlo. </li><li> Risciacquare tutte le cellule fuori il piatto, e utilizzare un raschietto (poliziotto in gomma) per raccogliere matrice come bene. Aggiungere il 5 ml di PBS. Prelevare un &#39;aliquota di contare durante la centrifugazione. </li><li> Centrifugare a 800 g per 5 min. </li><li> Aspirare e risospendere in PBS alla concentrazione di 5 - 10x 10 6 / ml. Negozio su ghiaccio fino iniettata (iniezione entro 30 min). </li><li> Inserire una gabbia contenente 4-5 settimana di vita femminile topi immunodeficienti (SCID ad esempio) all&#39;interno di una cappa sterile. </li><li> Spruzzare l&#39;area intorno al 4 ° (addominale) capezzolo con etanolo al 70%. </li><li> Iniettare 0,1 ml nel cuscinetto adiposo della mammella. Se un assistente può essere trovato, una persona può tenere il mouse in posizione mentre gli inserti di altri l&#39;ago all&#39;interno del cuscinetto di grasso mammario. Se si inietta da soli, mettere il mouse sotto anestesia con isoflurano luce. </li><li> Una volta che il tumore è cresciuto fino a 5-7 mm, la finestra Imaging mammaria (MIW) deve essere inserito. Nota: in alternativa, per alcune applicazioni, la MIW può essere inserito in cima alla sana pad mammaria grasso e le cellule possono essere iniettati in seguito. Questo approccio consente di imaging di cellule trasfettate transitoriamente in un ambiente fisiologico. </li></ol> 2. Fabbricazione manuale della finestra Imaging mammaria (MIW): <ol><li> MIWs (Figura 1A) sono fatti di plastica tessuto grado di garantire la biocompatibilità. Per la costruzione manuale, usiamo 5 o 10 piatti cm. </li><li> Mettere i guanti in lattice su. </li><li> Riscaldare un tessuto-cultura piatto e creat una superficie curva premendo un arrotondati, oggetto duro contro il piatto riscaldato (usiamo un 1-pollice bit dremmel per questo). </li><li> Tagliare il centro del piatto con una lama di rasoio riscaldato. </li><li> Utilizzare un piccolo, a forma di cono po dremmel per fare un buco nel centro della cupola a forma di base plastica (6-7mm di diametro). </li><li> Rendere i bordi della base in plastica completamente liscia da carteggiatura con il dremmel e ulteriormente archiviazione. </li><li> File in cima alla base in plastica facendo una superficie piana per il vetro coprioggetti. Il diametro della depositato superficie piana e deve essere 9-10mm. </li><li> Incollare la circolare 8 millimetri di vetro coprioggetto (numero 1) sulla superficie appiattita con il colla (cianoacrilato). </li><li> Attendere che la colla si asciughi (15 minuti). </li><li> Utilizzare un ago riscaldato 26G per fare otto fori sutura pungere da fuori (dove il vetro è) all&#39;interno della base. Fori devono essere distribuite uniformemente in tutto il coprioggetti, 0,5-1mm di distanza dal bordo del vetrino. </li><li> Allargare i fori con un 5-0 ago sutura. </li><li> Pungere fori nella base di plastica farà la superficie interna irregolare. Con carta vetrata, fanno di questa superficie completamente liscia. </li><li> Cambiare i guanti e pennello di piccole particelle di plastica dal MIW con un pennello di piccole dimensioni. </li><li> Lavare la MIW con acqua deionizzata. </li><li> Lavare la MIW utilizzando etanolo al 70%. Utilizzare un Q-tip per pulire il vetro quindi è completamente trasparente. Se ci sono macchie di nebbia presenti dal vapore colla, con attenzione l&#39;uso di acetone con un Q-tip. </li><li> Sterilizzare il MIW dall&#39;esposizione ai raggi UV per 3 ore a ogni lato. </li></ol> Semi-manuale di fabbricazione della finestra Imaging mammaria (MIW): Al fine di fabbricare la base in plastica, stiamo attualmente utilizzando stampi in gomma siliconica creati utilizzando hand-made MIWs. Lo stampo è composto da due parti di gomma di silicone che lo rendono una replica esatta della parte anteriore e posteriore della originale quando è riempita di resina poliestere e poi subito uniti. La resina poliestere liquido è mescolato 9:10 e si traduce in una struttura difficile quando è completamente guarito in 48h. La plastica è protetto UV e l&#39;archiviazione senza rottura verso il basso o di diventare giallo nel corso del tempo. Dopo che la base è curato, a pochi passi 2,8-2,16 sono fatti allo stesso modo per MIWs manualmente-made. 3. Inserimento del MIW: <ol><li> L&#39;area intorno al capezzolo 4 ° dovrebbe avere un piccolo (diametro 5-7 mm) del tumore diversi giorni / settimane dopo l&#39;iniezione di cellule tumorali a seconda del tipo di cellula (Figura 1B). Quanto tempo è passato dopo l&#39;iniezione di cellule che esprimono proteine ​​Dendra2 photoswitchable o altre proteine ​​fluorescenti dipende dalla linea cellulare utilizzato. Il tumore non deve essere visibilmente necrotico, e dovrebbe avere una pelle intatta con i capelli sulla parte superiore del tumore. I topi con tumori necrotico dovrebbe essere eutanasia. </li><li> Preparare lo spazio sterile per la chirurgia stabilire un pezzo di panno sterile all&#39;interno di una cappa sterile. Mettete un pezzo di sterile gauze nel mezzo, e c&#39;era una MIWs pochi e strumenti sterili attorno ad esso: usiamo piccole forbici standard, primavera forbici, pinzette microdissecting, pinze microdissecting, porta aghi. Mantenere sterile Q-tips, una bottiglia di etanolo al 70% e guanti sterili in un angolo della cappa. </li><li> Il mouse è anestetizzata nella cappa sterile utilizzando l&#39;iniezione IP del 2,5% Avertin (20 l / g) in HBSS o, in alternativa 10 mcg / kg di ketamina + 10 mcg / g xylazina (contattare l&#39;Istituto cura degli animali per le approvazioni e dell&#39;ordine). Nota: la soluzione deve essere preparata Avertin bi-settimanale, filtro sterilizzato usando un filtro di 0,22 micron e memorizzati fino a 500 aliquote microlitri a 4 ° C (al buio). </li><li> Eliminare i peli con la rasatura nella zona sopra il tumore con un rasoio piccolo animale. </li><li> Rimuovere il resto dei capelli con crema di rimozione dei capelli Nair (disponibile in farmacia). Pulire la pelle con etanolo immerso Q-tips. </li><li> Trasferire l&#39;animale sulla garza sterile e applicare una pomata oftalmica agli occhi per evitare che l&#39;essiccazione e infezioni. </li><li> Sterilizzare la pelle con Betadine e pulite, con etanolo al 70%. </li><li> Trasferire l&#39;animale su un panno sterile chirurgica all&#39;interno della cappa sterile. </li><li> Tirare la pelle immediatamente mediale al capezzolo con pinze e tagliare ~ incisione 2 millimetri nella pelle. </li><li> Separare il sottostante pad mammaria grasso della pelle con le forbici e pinze dissezione. La pelle e tratto foro durante questa fase di separazione a una dimensione che ospiterà l&#39;inserimento del MIW. </li><li> Se accidentalmente un vaso viene colpito durante sugery, utilizzare una sterile Q-tips per rimuovere il sangue che viene prodotto / per fermare l&#39;emorragia di diventare troppo oneroso. </li><li> Inserire il MIW tale che ci sia la pelle sulla parte superiore della base MIW e sutura in posizione con filo non riassorbibile e invertire il taglio ago. </li><li> Uso del tessuto adesivo o cianoacrilato per riempire i buchi sutura e fissare il MIW alla pelle. </li><li> Aggiungi TMP-SMX mix di antibiotici: (Sulfametossazolo 0,6 mg / ml, trimetoprim 0,12 mg / ml) nella gabbia bottiglia d&#39;acqua per 3 giorni prima e dopo l&#39;intervento. </li><li> L&#39;animale rimane sotto anestesia per 1-4h dopo l&#39;iniezione IP Avertin. Dal momento che l&#39;intervento richiede normalmente ~ 45 minuti, è importante per aiutare l&#39;animale recuperare in seguito: </li><li> Posizionare una piastra elettrica a mano (37 ° C) (disponibile nelle farmacie) sul fondo della gabbia e coprire con garza. </li><li> Tenere l&#39;animale in cima al pad fino a quando non si accende il suo stomaco e inizia a camminare. </li><li> Se l&#39;animale è incosciente per più di 3 ore, iniettare 0,3 ml di HBSS intraperitoneale per la reidratazione. </li><li> L&#39;animale è consentito di recuperare nei giorni prossimi 3-4 prima della sessione di imaging ha luogo la prima. </li></ol> 4. Imaging Box Costruzione La casella di imaging assicura che il MIW è seduto piatto, proprio sopra l&#39;obiettivo microscopio. Esso facilita anche la temperatura e il controllo costante del flusso d&#39;aria attraverso l&#39;anestesia di isoflurano. La scatola è realizzata in plexiglass e incollati tra loro con saldatura di plastica. E &#39;dotato per il palcoscenico microscopio specifico e quindi la forma del suo fondo varia a seconda del microscopio utilizzato (Figura 2 mostra lo schema della scatola fitted di mettere in scena Leica microscopio SP5). Dimensioni della scatola in centimetri sono L = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Figura 2A). La parte inferiore della finestra consiste in una piastra vuota, 12.7x8.4 cm, che si inserisce all&#39;interno della fase di microscopio Leica SP5, scorrevoli e due &quot;porte&quot;, 5,7 X 5,7 cm_each, che formano una apertura circolare (d = 2,22 centimetri ) quando è chiuso. Il MIW si inserisce in questa apertura. Il frontale contiene il foro d&#39;ingresso per l&#39;anestesia, mentre uno dei pezzi lato contiene un foro di uscita che porta al vuoto. Si noti che il condensatore e il supporto diapositive devono essere rimossi prima del posizionamento casella di imaging. 5. Box Imaging Usa <ol><li> Posto l&#39;animale in anestesia con isoflurano e applicare una pomata oftalmica per gli occhi. </li><li> Collegare lo scarico isoflurano dalla macchina per anestesia al fronte casella di imaging, sulla parte esterna del foro di ingresso (Figura 2B). </li><li> Collegare un secondo tubo al foro di uscita della scatola di imaging. Questo tubo deve essere collegato al filtro del gas e poi il vuoto. </li><li> Aprire il coperchio della scatola e aprire le porte box e posto l&#39;animale, MIW lato rivolto verso il basso, e facendo scorrere le porte nella casella. </li><li> Tenere la scatola e regolare le porte in basso in modo che la base MIW è detenuto e immobilizzato tra di loro. La base MIW dovrebbe essere allo stesso livello come le porte casella di imaging, mentre il coprioggetto MIW dovrebbe essere solo pochi millimetri sotto di questo livello. Assicurarsi che il posizionamento del MIW tra la parte inferiore porte scorrevoli assicura che il coprioggetto (porzione di vetro della MIW) in posizione orizzontale, parallelo alle porte fondo della scatola. Questo farà sì messa a fuoco corretta. </li><li> Abbassare l&#39;obiettivo microscopio, per consentire lo spazio per il posizionamento del box aparte superiore del palco microscopio. </li><li> Porre il recipiente sul palco microscopio, e regolare la fase in modo che il coprioggetto MIW è sopra l&#39;obiettivo. </li><li> Mettere a fuoco l&#39;obiettivo e iniziare imaging. </li><li> Durante l&#39;utilizzo di isoflurano, l&#39;animale deve essere controllata mediante ispezione visiva della frequenza respiratoria. Questo può essere fatto visivamente, o attraverso il monitoraggio della frequenza del respiro artefatti che appaiono durante la raccolta di immagini (che possono interferire con l&#39;acquisizione dati). L&#39;ossimetria MouseOx impulso di sistema (Starr vita Sciences Corp) è stato utilizzato con successo. In questo modo i dati possono essere raccolti continuamente senza accendere le luci nella stanza per controllare l&#39;animale. Nota: Dopo ogni sessione di imaging, il recupero degli animali dovrebbe essere agevolata avvolgendo una piccola piastra elettrica a mano in garza o Kimwipes e metterlo sotto l&#39;animale in gabbia. Nota: Se un obiettivo ad immersione viene utilizzata per l&#39;immagine attraverso la MIW, il mezzo di immersione (glicerolo, acqua, olio) dovrebbe essere rimosso dalla finestra di imaging. Il MIW deve essere ispezionato per eventuali crepe o altri danni che potrebbero essersi verificati durante l&#39;imaging. Questo è fondamentale per la raccolta di dati durante le sessioni di immagini multiple. </li></ol> 6. Photoswitching e l&#39;imaging di Dendra2 marcato le cellule La procedura è descritta per il microscopio confocale Leica SP5, la potenza del laser sul piano focale, gli obiettivi e le opzioni software disponibili variano se si utilizzano altri microscopi confocale o immagini multiphoton impostare, e quindi il protocollo descritto di seguito deve essere utilizzato come una guida per ottimizzare l&#39;esperimento sul microscopio. <ol><li> Osservando il tumore attraverso l&#39;oculare (10x) con il filtro fluorescenza verde, individuare i vasi sanguigni principali che sono visibilmente fluide e ben distesa sullo stesso piano focale. </li><li> Posizione di una delle navi nel centro del campo e passare alla rilevazione PMT. </li><li> Impostare insieme sequenziale di imaging per due canali. Uno dei canali utilizza 488nm linea laser (10% di potenza), e raccoglie scattering da matrice extracellulare (480-495nm) e le emissioni dalla forma verde di Dendra2 (505-540nm). Il secondo canale utilizza la linea di laser a 543nm (90% di potenza) e raccoglie le emissioni dalla forma rossa di Dendra2 (555-600nm). Raccogliere immagini 3D pre-photoswitching. </li><li> Utilizzare l&#39;opzione ROI scansione photoswitch una popolazione di cellule scelto utilizzando la linea laser di 405nm (30% di potenza, scansioni 20-40). Raccogliere emissione della forma rossa della proteina di monitorare la commutazione. </li><li> Utilizzando la stessa routine sequenziale come in 6.3, raccolta post-switching immagini 3D. </li><li> Se photoswitching più di una regione nel tumore, si consiglia di scattare foto attraverso la oculari utilizzando una fotocamera digitale, in entrambi i canali verde e rosso (Figura 3A, B). Questo aiuterà l&#39;orientamento durante le sessioni di imaging successive. Nota: Inoltre, i vasi sanguigni può essere temporaneamente etichettato con coda vena iniezione di destrano fluorescente (Cascade blu o Alexa Fluor 647, entrambi 10kDa). Poche ore dopo l&#39;iniezione, destrani lascerà i vasi sanguigni e in modo permanente l&#39;etichetta macrofagi. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Figura 3C mostra una regione rettangolare photoswitched (rosso) orientata ortogonalmente rispetto al vaso sanguigno (non fluorescenza). Non photoswitched cellule sono verdi, mentre la dispersione della matrice extracellulare è viola. L&#39;immagine è una proiezione intensità massimo di quattro immagini lungo l&#39;asse Z (20-50 micron di profondità).

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	<li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein.">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li><li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. 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C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+behavior+in+metastatic+primary+mammary+tumors+correlated+with+gene+expression+patterns+revealed+by+molecular+profiling.">Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling.</a> Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).</li><li>Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. 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<table><tbody><tr><td>PBS w/o Ca, Mg</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM media (MDA-MB-231 cells)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane(Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td># NDC 10019-773-40</td><td></td></tr><tr><td>SCID mouse</td><td>National Cancer Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Culture dishes</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Custom Order</td></tr><tr><td>Circular coverslip 8 mm</td><td>Scientific, Inc.</td><td>8CIR-1-FIS</td><td></td></tr></tbody></table>

dendra2 photoswitching through the mammary imaging window

Nell&#39;ultimo decennio, la microscopia intravitale dei tumori al seno in topi e ratti a singola cella di risoluzione<sup&gt; 1-4</sup&gt; Ha portato a importanti conoscenze sui meccanismi di comportamento metastatico come la migrazione, invasione e intravasation delle cellule tumorali<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, L&#39;angiogenesi<sup&gt; 3</sup&gt; E la risposta immunitaria delle cellule<sup&gt; 7-9</sup&gt;. Abbiamo recentemente segnalato una tecnica di immagine ortotopico carcinomi mammari su più sessioni di imaging intravitale in topi vivi<sup&gt; 10</sup&gt;. Per questo, abbiamo sviluppato una finestra mammaria Imaging (MIW) e parametri di imaging ottimizzato per Dendra2<sup&gt; 11</sup&gt; Photoswitching e imaging<em&gt; In vivo</em&gt;. Qui, descriviamo il protocollo per la produzione di MIW, inserimento del MIW sulla cima di un tumore e imaging del Dendra2 marcato le cellule tumorali mediante una casella personalizzata di imaging costruito. Questo protocollo può essere usato per l&#39;immagine del comportamento metastatico delle cellule tumorali in microambienti distinti in tumori e permette l&#39;imaging a lungo termine dei vasi sanguigni, le cellule tumorali e cellule ospiti.

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Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Photoswitching intravitale e tracking di Dendra2 marcato le cellule tumorali attraverso la finestra Imaging mammaria è una tecnica che ci permette di immagine il comportamento metastatico delle cellule tumorali in microambienti tumorali scelto su una scala temporale di giorni.

Dendra2 Photoswitching attraverso la finestra Imaging mammaria

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University. Photoswitching intravitale e tracking di Dendra2 marcato le cellule tumorali attraverso la finestra Imaging mammaria è una tecnica che ci permette di immagine il comportamento metastatico delle cellule tumorali in microambienti tumorali scelto su una scala temporale di giorni.

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A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

Ricerca

Biologia

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging windows is particularly powerful because it allows longitudinal observation of the same tissue over days to weeks. Typical imaging windows comprise a glass coverslip in a biocompatible metal frame sutured to the mouse&#8217;s skin. These windows can interfere with the free movement of the mice, elicit a strong inflammatory response, and fail due to broken glass or torn sutures, any of which may necessitate euthanasia. To address these issues, windows for long-term abdominal organ and mammary gland imaging&#160;were developed from a thin film of polydimethylsiloxane (PDMS), an optically clear silicone polymer previously used for cranial imaging windows. These windows can be glued directly to the tissues, reducing the time needed for insertion. PDMS is flexible, contributing to its durability in mice over time&#8212;up to 35 days have been tested. Longitudinal imaging is imaging of the same tissue region during separate sessions. A stainless-steel grid was embedded within the windows to localize the same region, allowing the visualization of dynamic processes (like mammary gland involution) at the same locations, days apart. This silicone window also allowed monitoring of single disseminated cancer cells developing into micro-metastases over time. The silicone windows used in this study are simpler to insert than metal-framed glass windows and cause limited inflammation of the imaged tissues. Moreover, embedded grids allow for straightforward tracking of the same tissue region in repeated imaging sessions.

An approach is here presented for long-term intravital imaging using optically clear, silicone windows that can be glued directly to the tissue/organ of interest and the skin.&#160;These windows are cheaper and more versatile than others currently used in the field, and the surgical insertion causes limited inflammation and distress to the animals.

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

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Ricerca sul cancro

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Imaging pancreatico murino utilizzando una finestra stabilizzata impiantata

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have high morbidity and mortality. Intravital imaging (IVI) is a powerful technique enabling the high-resolution imaging of tissues in both healthy and diseased states, allowing for real-time observation of cell dynamics. IVI of the murine pancreas presents significant challenges due to the deep visceral and compliant nature of the organ, which make it highly prone to damage and motion artifacts. 
Described here is the process of implantation of the Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). The SWIP allows IVI of the murine pancreas in normal healthy states, during the transformation from the healthy pancreas to acute pancreatitis induced by cerulein, and in malignant states such as pancreatic tumors. In conjunction with genetically labeled cells or the administration of fluorescent dyes, the SWIP enables the measurement of single-cell and subcellular dynamics (including single-cell and collective migration) as well as serial imaging of the same region of interest over multiple days. 
The ability to capture tumor cell migration is of particular importance as the primary cause of cancer-related mortality in PDAC is the overwhelming metastatic burden. Understanding the physiological dynamics of metastasis in PDAC is a critical unmet need and crucial for improving patient prognosis. Overall, the SWIP provides improved imaging stability and expands the application of IVI in the healthy pancreas and malignant pancreas diseases.

Autore in primo piano: Rivoluzionare la comprensione della malattia pancreatica attraverso l'imaging intravitale avanzato 

We present a protocol for the surgical implantation of a stabilized indwelling optical window for subcellular-resolution imaging of the murine pancreas, allowing serial and longitudinal studies of the healthy and diseased pancreas.

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Consegna intraduttale al Coniglio ghiandola mammaria

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Bioingegneria

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

Microscopia intravitale longitudinale utilizzando una finestra di imaging mammario con coperchio sostituibile

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Dendra2 Photoswitching attraverso la finestra Imaging mammaria

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

Consegna intraduttale al Coniglio ghiandola mammaria

Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

Microscopia intravitale longitudinale utilizzando una finestra di imaging mammario con coperchio sostituibile

Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria