Vorremmo riconoscere giugno Yamamoto per il suo design e la costruzione del automatico, dispositivo motorizzato tetrodo tornado rappresentato nel video. Inoltre, vorremmo ringraziare tutti i membri passati e presenti Lab Wilson per il loro contributo a micro-drive e la tecnologia di sviluppo tetrodo in laboratorio.

1. Fabbricazione di tetrodi <ol><li> Iniziare la costruzione di un tetrodo ottenendo un 50 cm di lunghezza, poliammide isolati, ni-cromo filo con un nucleo di 12,5 micron di diametro. Piegare il filo a metà. Correre le dita lungo la coppia per farli stare insieme. Assicurarsi che la coppia di fili hanno un buon contatto per tutta la loro lunghezza. </li><li> Piegare la coppia ancora una volta tenendo insieme le due estremità. Assicurarsi che il ciclo formata da un lato non sia piegato. Tagliare i quattro fili sulla non-loop estremità in modo che le quattro punte sono allineati. </li><li> Per il passo successivo, avrete bisogno di un coccodrillo modificato, un dispositivo di rotazione motorizzata, e una barra orizzontale sopra il dispositivo di svolta. Il coccodrillo è stato modificato incollando una barra di plastica alla base della clip. Dove le punte del filo sono esposti, morsetto i quattro fili insieme al coccodrillo modificato. Appendere il ciclo di fili sulla barra orizzontale. Posizionare il coccodrillo nella fase motorizzato. </li><li> Applicare 80 in senso orario colpi di scena, seguita da 40 colpi di scena in senso orario in contrasto con il fascio cavi nel corso di circa tre minuti. Questi parametri possono essere variati secondo le vostre esigenze. </li><li> Dopo torsione tetrodo è completato, fondere insieme i fili da riscaldamento da tre diverse angolazioni con una pistola di calore (420 ° C o 790 ° F), con medio-basso flusso. Per ogni angolo, cominciano 1-2 cm sotto il fascio di fili in cui si divide, eseguire la pistola di calore verso il basso e fino ad una distanza di 2 cm dal filo per circa 5 secondi. Prestare attenzione, come le alte temperature si scioglieranno completamente l&#39;isolamento e portare a corto circuiti. </li><li> Ora che i fili sono fusi insieme, rimuovere il tetrodo dall&#39;apparato torsione delicatamente sollevando il coccodrillo per alleviare la tensione sul tetrodo, e tagliare il tetrodo vicino al coccodrillo. All&#39;altra estremità, tagliare il circuito in modo tale che ci sono quattro settori non legati di filo di uguale lunghezza. </li><li> Quindi, separare i singoli fili in alto con delicatezza piegando i fili con una pinzetta a punta morbida. </li><li> Il tetrodo è pronto da caricare nel micro-drive array. Fai 21-25 più tetrodi e riporle in una scatola di polvere fino a quando non è tempo per il processo di caricamento tetrodo. </li></ol> 2. Caricamento dei tetrodi e fili di terra nel micro-array di unità <ol><li> Per procedere, è necessario un completo micro-drive array. Se non hai ancora costruito uno, fare riferimento al video di &#39;micro-drive array per cronica in vivo di registrazione:. Fabbricazione guidare&#39; Nel nostro piano di progettazione, il tetrodo saranno fissati ad una estremità di connettore hardware, e si svolgerà attraverso la poliimmide tubo portante nel micro-drive in modo che le punte degli elettrodi estendersi al di sotto della base del micro-drive array. </li><li> Prima di iniziare, costruire un supporto disco che può essere collegato al connettore della scheda da un lato, e dall&#39;altro lato, possono essere bloccati da un Panavise. In questo esempio, l&#39;unità è titolare di un mulino-max connettore incollato ad una estremità di un X-acto manico del coltello (Figura 1c). </li><li> Tenendo il tetrodo con una pinzetta a punta morbida e l&#39;utilizzo di uno stereoscopio, spingere la punta del tetrodo in poliimmide tubo portante di uno dei micro-unità. Spingere il tetrodo nel tubo fino a quando i fili elettrodi individuali sono vicino al connettore della scheda in alto l&#39;array di unità. Fare attenzione a non piegare o piegare i cavi, in quanto che farà sì che il tetrodo di entrare nel cervello in un angolo, piuttosto che perpendicolare, e indebolire l&#39;integrità del tetrodo. </li><li> Delicatamente alimentare l&#39;altra estremità dei quattro fili nei loro rispettivi fori nella scheda di interfaccia elettrodo utilizzando una pinzetta a punta morbida. Anche in questo caso, evitare torsioni o piegare i fili. Con tutti e quattro i fili in posizione, spingere i perni di oro in loro buchi con un paio di pinze che hanno una mascella inferiore accorciato. Quando i perni vengono spinti nel foro, si eliminerà l&#39;isolamento del filo e creare un collegamento elettrico. </li><li> Per il successivo riferimento, tenere traccia della mappatura tra micro-unità e posizione del perno sulla scheda di interfaccia elettrodo. </li><li> Continuare a caricare un totale di 18 tetrodi. I tre restanti micro-drive sulla matrice verrà utilizzata per ospitare gli elettrodi di riferimento. Ogni elettrodo di riferimento è costituito da un tetrodo che utilizza solo una delle quattro estremità del cavo non legate. Per collegare gli elettrodi di riferimento, seguire la procedura di caricamento, ma allegare solo uno dei quattro elettrodi al pin rispettivi elettrodo di riferimento sulla scheda connettore. </li><li> Se avete in programma multi-sito registrazioni, può essere utile per pianificare le connessioni dal tetrodi al connettore della scheda prima del tempo. Questo dovrebbe ridurre al minimo la possibilità di regolare la tetrodo sbagliato durante gli esperimenti. </li><li> Una volta che il caricamento tetrodo è completato, fare due fili di terra, uno per l&#39;animale e uno per il cono di protezione. Tagliare una 6 &#39;lungo filo di acciaio coibentato (testo: 0,005&#39; diametro) e rimuovere i 3 mm di isolamento, utilizzando una pinzetta in metallo, da ogni estremità del filo. Poi tagliare a 4&#39;Filo d&#39;acciaio lungo isolati (testo: 0,005&#39; diametro). Rimuovere 3 millimetri di isolamento da un lato e 1 cm all&#39;altra estremità. </li><li> Via cavo di terra il 6 &#39;attraverso il foro sul lato del micro-drive array e verso la scheda di interfaccia. Collegare il filo esposto alla scheda di interfaccia elettrodo con una spilla d&#39;oro alla buca terreno designato. Questo filo si collega al cranio dell&#39;animale. </li><li> Il 4 &#39;via cavo parallelo di terra al conduttore di terra installato in precedenza. Collegare l&#39;estremità 3 millimetri spogliata per la scheda di interfaccia elettrodo con una spilla d&#39;oro a un altro buco terreno designato. Questo filo sarà poi collegato ad un cono protettivo, che agirà come una gabbia di Faraday piccolo per ridurre il rumore di fondo. Ora siamo finiti fili di collegamento e può procedere con la raffinazione del nostro tetrodi. </li></ol> 3. Impostazione della lunghezza del tetrodi <ol><li> Il nostro obiettivo in questo processo è quello di tagliare tutti i tetrodi in modo che siano leggermente più lungo della profondità della struttura cerebrale di destinazione. Nel nostro esempio, le micro-unità sono progettate per una corsa massima di 5-6 mm, sufficiente per raggiungere molte aree neocorticale e l&#39;ippocampo dorsale di un topo adulto. In primo luogo, abbassare tutte le micro-unità e consente di tetrodi sono massimamente esposti. Contemporaneamente tagliare tutti i tetrodi di lunghezze che sono circa 5 mm più lunga della lunghezza desiderata finale con un paio di forbici forte multa. </li><li> Per il taglio finale, preparare un paio di forbici dentellate in un Panavise. Morsetto una maniglia con una leggera angolazione verso il basso e con dentellature verso l&#39;alto, lasciando l&#39;altra maniglia penzolante. </li><li> Ora completamente ritirare tutte le tetrodi nelle loro cannula guida ruotando il micro-drive up. </li><li> Utilizzando uno stereoscopio, estendere completamente uno tetrodo fuori dalla sua cannula. Usando una, posizione righello le forbici dentellate alla distanza desiderata dalla cannula guida. Lentamente e delicatamente tagliare il tetrodo con un movimento regolare. Dopo questo tetrodo è stata tagliata, ritirare il micro-drive da 3-4mm. Ripetere questo processo per ogni tetrodo fino a che tutti sono stati tagliati. A questo punto siete pronti per la placcatura in oro. </li></ol> 4. Doratura di tetrodi e controllo di qualità Doratura i fili tetrodo nichelcromo è fondamentale per le registrazioni a lungo termine stabile. Previene la corrosione e migliora la biocompatibilità. <ol><li> Installazione del misuratore di impedenza in modalità esterna e il generatore di corrente in modalità di controllo DC con uscita audio (Figura 1d). Toccare i due cavi della corrente del generatore per le sei possibili coppie di canali all&#39;interno di ogni tetrodo, e utilizzare il feedback audio per stabilire se esistano cortocircuiti tra le coppie. Se esiste una breve, ri-tagliare il tetrodo con le forbici dentellate e ripetere il test. Se il problema persiste, eliminare il tetrodo e sostituirla. </li><li> Quando non esistono all&#39;interno pantaloncini tutte le tetrodi, spostare tutti i micro-unità verso il basso, si estende tutte le tetrodi più lontano possibile. </li><li> Modificare la configurazione di apparecchiature per il controllo dell&#39;impedenza dell&#39;elettrodo (Fig. 1e). Ora immergere le punte di tutti i tetrodi in un bagno di standard di doratura soluzione. Il bagno d&#39;oro è collegato elettricamente al cavo positivo del misuratore di impedenza. Controllare l&#39;impedenza dell&#39;elettrodo toccando il polo negativo del contatore impedenza al pin corrispondente connettore sulla scheda. </li><li> Misurare e registrare l&#39;impedenza di ogni filo sulla micro-drive array. I valori normali vanno da MOhm 1-3. </li><li> Sul generatore di corrente, impostare la corrente tra 1-3 μA. Successivamente, in modo sicuro collegare il polo negativo del contatore impedenza al pin sulla scheda connettore. Posizionare l&#39;apparecchiatura nella configurazione galvanica (Figura 1f). Sul misuratore di impedenza, passare rapidamente dalla modalità normale, in modalità bypass, e viceversa. In modalità bypass, la corrente passerà attraverso il tetrodo e la soluzione di oro e oro sarà placcato sulla punta dell&#39;elettrodo. L&#39;impedenza dopo ogni turno di placcatura dovrebbe essere inferiore rispetto a prima. Ripetere l&#39;impulso di corrente se l&#39;impedenza non scenda sotto l&#39;1 MOhm. Una serie conservatore di impedenze accettabili sono 250kOhm a 350 kOhm. Se l&#39;impedenza scende al di sotto di 200 kOhm, ciò può indicare un corto circuito. </li><li> Se dopo ripetuti impulsi l&#39;impedenza non scende sufficientemente, la punta dell&#39;elettrodo può essere ostruito. Ri-tagliare il tetrodo, verificare la presenza di cortocircuiti, e ripetere il processo di doratura. Se ri-taglio non aiuta, sostituire il tetrodo e ricominciare. </li><li> Dopo la placcatura tutti tetrodi, immergere le punte tetrodo brevemente in etanolo, e lasciarli asciugare per 3 a 5 minuti. </li><li> Test per i cortocircuiti all&#39;interno tetrodi utilizzando il generatore di corrente con le punte tetrodo esposto all&#39;aria. Se una connessione continua fra due o più elettrodi di un tetrodo, ri-tagliare il tetrodo, e la piastra d&#39;oro di nuovo. </li><li> Dopo la doratura di tutte le tetrodi è completa, aggiungere una goccia di medio spessore ciano-acrilato colla per l&#39;interfaccia tra ogni tetrode ed il suo poliimmide tubo. Questo garantirà il tetrodo alla sua micro-drive e di mantenere la lunghezza del tetrodo. </li><li> Come ultimo passo, spostare tutti i tetrodi nell&#39;unità girando tutte le viti in su. </li></ol> 5. Collegamento del cono di protezione Lo scopo del cono protettivo è di scudo micro-unità e il filo tetrodo esposti dall&#39;ambiente. Fornisce inoltre supporto per la gestione durante un esperimento e riduce il rumore elettrico. Usiamo un 3-D cono di plastica stampata (Parte I Riferimento: fabbricazione di unità). Tuttavia, è possibile fare il cono da altri materiali, come un pezzo curvo di lattina. <ol><li> Prendere il cono in plastica e fissare del nastro adesivo un foglio di alluminio sulla superficie interna o esterna. </li><li> Successivamente, praticare un piccolo foro (1,5 mm di diametro) attraverso il cono e fissare liberamente una vite con una rondella e un dado all&#39;interno del cono. Questo servirà come un passaggio elettrica per il cavo di massa. Si consiglia di utilizzare uno 0-80 vite dimensioni e la combinazione rondella. </li><li> In primo luogo, inserire e parzialmente curva tre viti 1-72 dimensioni (3 / 16 cm di lunghezza) in entrambi i lati del cono. Con l&#39;array di unità sospeso, inserire il cono sopra l&#39;unità. Assicurarsi che entrambi i fili di terra si estendono dalla parte inferiore del array di unità. Avvolgere la parte esposta del cavo di terra del 4 &#39;intorno a una delle viti 1-72 volte e fissare saldamente la vite. Fissare il cono alla base guidare serrando le rimanenti due viti cono. </li><li> Infine, prendere la 1 centimetro fine spogliato del cavo di terra breve e avvolgetele intorno alla vite, tra il nastro di alluminio e la rondella. Fissare il terreno stringendo la vite. Ora abbiamo un micro-drive array è finalmente pronto per l&#39;impianto chirurgico. </li></ol> 6. Rappresentante risultati <ol><li> Micro-drive produzione di serie è ora completa. Il tuo micro-drive array è caricato con 18 tetrodi e 3 canali di riferimento. E &#39;racchiuso in un cono protettivo e cappuccio per la durevolezza. Il termine di micro-array di unità con cono protettivo pesa 20g a 25g in media. </li><li> L&#39;array di unità finito è impiantato utilizzando le normali procedure chirurgiche. Come potete vedere, l&#39;unità è collegata a un chip preamplificatore e un fascio di fili che trasportano il segnale di hardware di acquisizione dati e software. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1: A) Schema di configurazione torsione tetrodo. Una barra orizzontale sospende i cavi elettrodo non legate del tetrodo sopra il dispositivo automatico torsione tetrodo. B) l&#39;installazione di misurazione dell&#39;impedenza dell&#39;elettrodo tetrodo e placcature. Durante il controllo di corto circuiti, il circuito è diverso:. Il filo nero collegato a un altro canale di elettrodi sul connettore della scheda C) Un primo piano di una misura micro-drive portautensili array. La barra cilindrica è un X-Acto manico del coltello. Il connettore è un 26-pin, doppia fila, Mill-max connettore. I due pezzi sono legati tra loro con acrilico dentale. D) di configurazione per il controllo a breve. Canale X e Y sono Canale due canali diversi dei quattro canali tetrodo. E) di configurazione per la misurazione dell&#39;impedenza dell&#39;elettrodo. La sorgente di corrente è &#39;off&#39;. Il misuratore di impedenza è impostato a &#39;on&#39; e &#39;test&#39;. F) di configurazione per la doratura delle punte degli elettrodi. La sorgente di corrente è impostato su &#39;su&#39;, l&#39;audio è &#39;on&#39;, la modalità è &#39;unipolare&#39;, Test DC è &#39;on&#39;, la corrente è impostato su 2 microampere.

<ol>
	<li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex.">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li></ol>

Questo protocollo è la seconda rata di un protocollo in due parti: &quot;Micro-drive array per cronica in vivo di registrazione.&quot; La combinazione di array di micro-drive e tetrodo è un potente strumento per l&#39;ottenimento di registrazioni simultanee di molti neuroni in una veglia, comportarsi preparazione animali. Speriamo di aver fornito tutte le informazioni necessarie per voi sarà necessario iniziare o migliorare le registrazioni elettrofisiologiche nel proprio laboratorio. Il ...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Panavise</td>
<td>Tool</td>
<td>Panavise</td>
<td>Model 301</td>
<td>Holds either micro-drive array or serrated scissors</td>
</tr>
<tr>
<td>Modified Xcelite 378M Pliers</td>
<td>Tool</td>
<td>Newark</td>
<td>96F8903</td>
<td>For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.</td>
</tr>
<tr>
<td>Slow Cure Glue</td>
<td>Material</td>
<td>Great Planes (Champaign, IL)</td>
<td>GPMR6015</td>
<td>To glue the tetrode to the micro-drive</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold Plating Solution</td>
<td>Material</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Sifco Selectron Gold NC</td>
<td>Contains gold particles for electroplating</td>
</tr>
<tr>
<td>Current Generator</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>A365D-B</td>
<td>A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.</td>
</tr>
<tr>
<td>Impedance Meter</td>
<td>Tool</td>
<td>BAK Electronics</td>
<td>IMP-1 / 6662 / 2788</td>
<td>To check impedance of electrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Hot Air Gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Steinel (Germany)</td>
<td>HG 3002 LCD</td>
<td>To fuse electrodes together to make tetrode</td>
</tr>
<tr>
<td>Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers</td>
<td>Tool</td>
<td>Aven (Ann Arbor, MI)</td>
<td>18768 (Pattern 304)</td>
<td>For handling tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Alligator Clip</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18050-35</td>
<td>A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomedical Research Instruments</td>
<td>25-1000</td>
<td>For general cutting of tetrode/electrode wire</td>
</tr>
<tr>
<td>Iris Toughcut Serrated Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14058-09</td>
<td>For final cut of tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Teflon Coated Stainless Steel Wire</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems (Carlsborg, WA)</td>
<td>790500</td>
<td>Ground wire</td>
</tr>
<tr>
<td>12.5 micron nichrome wire</td>
<td>Material</td>
<td>Kanthal Palm Coast</td>
<td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td>
<td>Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tetrode Twister</td>
<td>Tool</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Tetrode Assembly Station</td>
<td>Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.

</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver Paint</td>
<td>Material</td>
<td>GC Electronics</td>
<td>22-023</td>
<td>For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)</td>
</tr>
<tr>
<td>X-Acto Knife Handle</td>
<td>Material</td>
<td>MSC Direct</td>
<td>X3001</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>
<tr>
<td>26 Pin, 2 Row Connector</td>
<td>Material</td>
<td>Mill-max</td>
<td>852-10-026-30-001000</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly

Il tetrodo, un fascio di quattro elettrodi, ha dimostrato di essere un prezioso strumento per la registrazione simultanea di più neuroni in vivo. L&#39;ampiezza differenziale di firme del potenziale d&#39;azione sui canali di un tetrodo permette l&#39;isolamento di singole unità di attività da più unità segnali. La capacità di controllare con precisione la posizione stereotassica e la profondità della tetrodo è fondamentale per lo studio coordinato l&#39;attività neurale in tutte le regioni del cervello. In combinazione con un micro-drive array, è possibile ottenere il posizionamento preciso e un controllo stabile di tetrodi molti nel corso di giorni o settimane. In questo protocollo, dimostriamo come fabbricare e tetrodi condizione utilizzando strumenti e materiali di base, installare il tetrodi in un multi-drive array tetrodo per la cronica in-vivo di registrazione nel ratto, le connessioni filo di terra al micro-drive array, e allegare un cono protettivo sulla serie di micro-drive per proteggere i tetrodi dal contatto fisico con l&#39;ambiente.

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Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

In questo protocollo dimostriamo come fabbricare e tetrodi condizione per l&#39;utilizzo con un micro-drive array, che è stato progettato per registrazioni elettrofisiologiche cronica nei ratti. Inoltre, illustrare le fasi finali della costruzione di micro-drive array, che include l&#39;installazione di cavi di terra e un cono protettivo.

Micro-drive array per la cronica In vivo</emRegistrazione>: tetrodo Assemblea

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-tetrode-assembly

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

33.1K Views.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. In questo protocollo dimostriamo come fabbricare e tetrodi condizione per l'utilizzo con un micro-drive array, che è stato progettato per registrazioni elettrofisiologiche cronica nei ratti. Inoltre, illustrare le fasi finali della costruzione di micro-drive array, che include l'installazione di cavi di terra e un cono protettivo.

Video: Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Applicazione della Luce cured resina adesiva dentale per montaggio elettrodi o sonde Microdialisi negli esperimenti cronica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Ricerca

Biologia

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunoistochimica su sezioni di paraffina di epidermide mouse utilizzando anticorpi fluorescenti

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

Un Chirurgia Procedura Craniotomia per l&#39;imaging cerebrale cronica

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

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In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. Lightweight recording devices carrying a high density array of tetrodes allow for the simultaneous monitoring of the activity of tens to hundreds of individual neurons. Here we describe a protocol for the fabrication of a micro-drive array with twenty one independently movable micro-drives. This device has been used successfully to record from hippocampal and cortical neurons in our lab. We show how to prepare a custom designed, 3-D printed plastic base that will hold the micro-drives. We demonstrate how to construct the individual micro-drives and how to assemble the complete micro-drive array. Further preparation of the drive array for surgical implantation, such as the fabrication of tetrodes, loading of tetrodes into the drive array and gold-plating, is covered in a subsequent video article.

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

In this protocol we demonstrate how to fabricate a micro-drive array for chronic electrophysiological recordings in rats.

Micro-drive array per la cronica In vivo</emRegistrazione>: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Assemblaggio, carico, allineamento e di una cella analitica del campione Ultracentrifuga

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;esposizione a dosi molto basse di beta e gamma Radiazioni

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Micro-drive array per la cronica In vivo: tetrodo Assemblea

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