Un sistema microfisiologico cardiaco per lo studio della propagazione del Ca²⁺ tramite stimolazione ottica non genetica

L'uso della luce per controllare le cellule e i tessuti cardiaci consente la stimolazione senza contatto, preservando così lo stato naturale e la funzione delle cellule, rendendolo un approccio prezioso sia per la ricerca di base che per le applicazioni terapeutiche.

I modelli microfisiologici cardiaci in vitro sono altamente affidabili per la ricerca scientifica, lo sviluppo di farmaci e le applicazioni mediche. Sebbene ampiamente accettati dalla comunità scientifica, questi sistemi sono ancora limitati nella longevità a causa dell'assenza di tecniche di stimolazione non invasive. I fototrasduttori forniscono un metodo di stimolazione efficiente, offrendo un approccio wireless con un'elevata risoluzione temporale e spaziale, riducendo al minimo l'invasività nei processi di stimolazione. In questo manoscritto, presentiamo un metodo completamente ottico per stimolare e rilevare l'attività di un modello microfisiologico cardiaco in vitro. In particolare, abbiamo fabbricato tessuti anisotropi laminari ingegnerizzati seminando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CM) generati in una coltura in sospensione di bioreattore 3D. Abbiamo impiegato un fototrasduttore, un derivato dell'azobenzene anfifilico, chiamato Ziapin2, per la stimolazione e un colorante Ca²⁺ (X-Rhod 1) per monitorare la risposta del sistema. I risultati dimostrano che Ziapin2 può fotomodulare le risposte del Ca²⁺ nel sistema impiegato senza compromettere l'integrità, la vitalità o il comportamento dei tessuti. Inoltre, abbiamo dimostrato che l'approccio di stimolazione basato sulla luce offre una risoluzione simile rispetto alla stimolazione elettrica, l'attuale gold standard. Nel complesso, questo protocollo apre prospettive promettenti per l'applicazione di Ziapin2 e della fotostimolazione basata su materiali nella ricerca cardiaca.

L'uso della luce per stimolare cellule e tessuti viventi sta emergendo come un significativo punto di svolta nella ricerca biomedica, offrendo capacità di stimolazione touchless con una precisa risoluzione temporale e spaziale 1,2,3,4,5,6. Una delle principali tecniche utilizzate per rendere le cellule sensibili alla luce è l'optogenetica, che prevede la modifica genetica delle cellule per esprimere canali ionici sensibili alla luce o pompe ^7,8. Questo approccio ha dimostrato un'efficacia impressionante nella regolazione delle cellule all'interno dei tessuti viventi; Tuttavia, la sua dipendenza dal trasferimento genico virale ha ostacolato la sua diffusa adozione nella ricerca e nelle applicazioni cliniche.

Per superare questa limitazione, materiali organici e inorganici sono stati utilizzati come trasduttori sensibili alla luce per sviluppare tecniche di stimolazione mediata dalla luce non genetiche e basate su materiali ^9,10. I fototrasduttori organici nanostrutturati 11,12,13,14,15 hanno recentemente dimostrato un notevole successo nell'innescare risposte cellulari in diverse applicazioni, tra cui neuroni, cardiomiociti e cellule muscolari scheletriche.

In questo articolo, proponiamo Ziapin2^16,17,18, un derivato dell'azobenzene, per studiare la propagazione del Ca²⁺ in tessuti cardiaci laminari ingegnerizzati. La struttura anfifilica della molecola consente un targeting preciso della membrana plasmatica cellulare, mentre il nucleo dell'azobenzene consente l'isomerizzazione indotta dalla luce, portando al suo cambiamento conformazionale 16,17,18. Nelle cellule cardiache, questa isomerizzazione trans-to-cis altera lo spessore della membrana plasmatica, inducendo una cascata di effetti che genera un potenziale d'azione, che a sua volta innesca il processo di eccitazione-contrazione 19,20,21.

Inoltre, descriviamo il processo di fabbricazione di una piattaforma ingegnerizzata per la crescita anisotropa del tessuto cardiaco²² e descriviamo in dettaglio la configurazione sperimentale utilizzata per innescare otticamente e monitorare la sua attività, con particolare attenzione all'acquisizione della dinamica del Ca²⁺ all'interno del tessuto^23,24. Infine, confrontiamo i segnali acquisiti con quelli ottenuti attraverso la stimolazione elettrica, che è considerata lo standard di riferimento. Nel complesso, questo protocollo evidenzia l'applicazione di un nuovo trasduttore sensibile alla luce per far progredire la nostra comprensione del comportamento cellulare cardiaco, in particolare nel contesto dei tessuti ingegnerizzati.

La coltura di cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC) utilizzata è una linea di iPSC maschile umana wild-type che ospita un sistema CRISPR/Cas9 inducibile dalla doxiciclina (Dox), creato introducendo CAGrtTA::TetO-Cas9 nel locus AAVS1 (Addgene: #73500). Lo studio è stato condotto in conformità con i protocolli approvati dal Boston Children's Hospital Institutional Review Board. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti prima della loro partecipazione allo studio. La generazione di cardiomiociti derivati da hiPSC (HIPSC-CM) è stata indotta come precedentemente descritto^25,26. Il protocollo sarà brevemente riassunto nella sezione seguente:

1. Generazione e preparazione di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

1. Lavare una volta le hiPSC coltivate in matracci T75 con PBS. Staccare le cellule incubandole con l'agente chelante Versene per 10-15 minuti e seminarle in recipienti del bioreattore pretrattati con una soluzione all'1% di tensioattivo non ionico a una densità di 50 milioni di IPSC/vaso in 100 mL di terreno E8 integrato con l'inibitore ROCK da 10 μM Y-27632.
2. Impostare i seguenti parametri del bioreattore: agitazione 60 giri/min, temperatura 37 °C, pH 7 e gassificazione di sovrapposizione (O₂ e CO₂) a 3 L/h standard.
3. Dopo 1 giorno in coltura, confermare che il diametro del corpo embrioide (EB) abbia raggiunto i 100-300 μm e trattare le cellule con terreno RPMI basico (terreno RPMI 1640 integrato con B27 meno insulina), contenente 7 μM CHIR99021 per 24 ore, seguito dal cambio del terreno in RPMI per altre 24 ore. Aggiungere un terreno RPMI basico contenente 5 μM di IWR-1-endo per altre 48 ore per avviare il processo di differenziazione verso la linea cardiaca. Dopo 48 ore, riportare il supporto all'RPMI di base.
4. Il giorno 7 di differenziazione, colture di cellule in un terreno RPMI di base integrato con insulina umana 1:1.000 (v/v). Aggiornare il supporto ogni 2 giorni o ogni giorno con una variazione del mezzo del 50% se il consumo di ossigeno supera il 30%.
5. Il giorno 15, dissociare enzimaticamente le cellule del bioreattore per 3 ore utilizzando una soluzione di collagenasi II contenente HBSS, collagenasi II (200 unità/mL), HEPES (10 mM), inibitore ROCK Y-27632 (10 μM) e N-benzil-p-toluenesulfonamide (BTS, 30 μM). Per fare ciò, lavare prima le EB differenziate di hiPSC-CM 2x con HBSS preriscaldato e incubarle in soluzione di collagenasi II (200 μl di volume di EB / 12 ml di soluzione di collagenasi II) a 37 °C in CO₂ al 5% fino a quando non compaiono singole cellule dalla dissociazione completa dell'EB.
6. Arrestare la reazione di dissociazione aggiungendo un volume uguale di tampone bloccante (RPMI-1640 senza B27 e DNasi II, con 6 μL di DNasi II per mL di RPMI-1640) alla sospensione a singola cellula. Contare le hiPSC-CM differenziate, centrifugare (200 × g, 5 min) e prepararsi per le applicazioni a valle congelando le cellule a -80 °C in isopropanolo per 24 ore e spostandole in serbatoi di azoto liquido fino alla semina.

2. Fabbricazione di tessuti laminari ingegnerizzati

1. Far aderire due strati di nastro da laboratorio, uno bianco e uno blu, a un foglio acrilico trasparente di 1 mm di spessore, resistente ai graffi e ai raggi UV. Utilizzando un incisore laser a CO₂ , tagliare la lastra acrilica in cerchi (20 mm di diametro per adattarsi ai 12 MW) e il modello di chip (3 quadrati da 7,5 mm, tre per chip) sul nastro come progettato nel software di grafica vettoriale (ad esempio, CorelDraw); parametri di taglio acrilico: 100 potenza, 20 velocità e 1.000 PPI; parametri di taglio del nastro: 8 potenza, 6 velocità e 1.000 PPI. Rimuovere i due strati di nastro adesivo all'interno della linea più interna usando una pinzetta, immergere le patatine in candeggina pura per 30 minuti a 1 ora per rimuovere le linee spesse e le macchie scure dal taglio, lasciando una linea nitida, e sciacquare le patatine in un becher con acqua corrente deionizzata (DI) durante la notte o per almeno 3 ore.
   NOTA: Non candeggiare per più di 2 ore, poiché ciò inciderà gli adesivi sulle pareti laterali, impedendo alla gelatina di aderire correttamente.
2. Sonicare i chip per 10 minuti e i timbri in polidimetilsilossano (PDMS, Sylgard 184) con le caratteristiche della scanalatura della linea (larghezza della cresta di 25 μm, larghezza della scanalatura di 4 μm e profondità della scanalatura di 5 μm) per 30 minuti in etanolo pulito al 70%. Trasferisci i trucioli e i timbri in un'area pulita sotto una cappa e lasciali asciugare sotto il flusso d'aria per ~1-2 ore.
3. Pesare 1 g di gelatina dalla pelle di maiale (forza del gel ~175 g Bloom, Tipo A) in una provetta da 50 ml. Aggiungere 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e mescolare accuratamente per garantire l'immediata dissoluzione della gelatina. Immergere la provetta in un bagnomaria a 65 °C per 30 minuti per completare il processo di dissoluzione. Allo stesso modo, pesare 1 g di transglutaminasi microbica (MTG) in una provetta separata da 50 ml. Aggiungere 12,5 mL di PBS, mescolare accuratamente e mettere la provetta in un bagnomaria a 37 °C per 30 minuti per garantire la completa dissoluzione dell'MTG.
4. Sonicare il tubo di gelatina per 15 minuti, quindi rimetterlo nel bagnomaria a 65 °C prima dell'uso. Posizionare il tubo MTG in un essiccatore con il tappo leggermente allentato e accendere l'aspirapolvere lentamente. Osservare le bolle che vengono rimosse dalla soluzione MTG sotto vuoto. Dopo il degasaggio, riportare il tubo MTG a bagnomaria a 37 °C.
   NOTA: Monitorare il processo e regolare il vuoto per evitare un'ebollizione vigorosa.
5. Copri un foglio di griglia con parafilm pulito, posiziona le patatine sulla griglia e tieni il timbro nelle vicinanze, pronto per l'uso. Aggiungere 5 mL di MTG ai 5 mL di soluzione di gelatina, pipettando accuratamente per evitare bolle; quindi, pipettare rapidamente la gelatina sul chip, usandone una quantità sufficiente a coprire l'area del chip (circa 0,5 ml ciascuno). Quindi, posizionare il timbro PDMS²² con motivo a linee (larghezza della linea 25 μm, altezza 5 μm, spaziatura 4 μm) sulla parte superiore e applicare un peso di 200 g per garantire che la gelatina sia modellata parallelamente all'asse longitudinale del tessuto. Una volta che tutte le patatine sono state modellate, copritele con un barattolo di vetro per evitare disturbi ambientali e lasciatele reticolare durante la notte.
   NOTA: Utilizzare la soluzione mista gelatina-MTG entro 5 minuti; In caso contrario, il modello target verrà alterato a causa di uno stato reticolato più elevato della gelatina.
6. Trasferire il chip e il sandwich con timbro PDMS in una nuova piastra P150 riempita con PBS e idratare la gelatina per 30 minuti a 1 ora per facilitare la separazione del timbro PDMS dal chip. Rimuovere la gelatina non modellata in eccesso attorno al chip e trasferire il chip pulito in un nuovo piatto P150 riempito di PBS. Conservare i timbri PDMS in etanolo al 70%.
7. Sterilizzare le patatine immergendole in etanolo per 10 minuti sotto la cappa.
   NOTA: Non superare i 10 minuti in etanolo, poiché un'esposizione più lunga potrebbe deformare la gelatina.
8. Trasferire le patatine nel PBS, immergerle per 10 minuti e risciacquare 3 volte. Preparare le soluzioni di rivestimento miscelando 20 μg/mL di fibronectina con una matrice di membrana basale diluita 1:100 in terreni di coltura (circa 0,5 mL per pozzetto). Rivestire i trucioli per 2 ore nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ o a 4 °C per una notte.
9. Scongelare e seminare le cellule (8 × 10⁵ hiPSC-CM per cm²) in terreno RPMI con Y-27632 (10 μM), quindi sostituirlo con RPMI senza Y-27632 dopo 24 ore.
10. Tre giorni dopo la semina delle cellule, rimuovere il nastro bianco usando una pinzetta.

3. Sintesi e applicazione del fototrasduttore

NOTA: Ziapin2 è stato sintetizzato secondo una procedura precedentemente pubblicata^16,18 ed è stato somministrato a hiPSC-CM direttamente nel terreno di coltura.

1. Aggiungere 25 μM di Ziapin2 alla coltura cellulare e incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per 7 minuti.
2. Lavare delicatamente le molecole in eccesso e risciacquare con terreno di coltura fresco.

4. Saggio di vitalità

NOTA: Alamar Blue è un test a base di resazurina in grado di permeare le cellule e fungere da indicatore redox per monitorare la vitalità cellulare. La resazurina si dissolve in tamponi fisiologici, dando luogo a una soluzione blu intenso che viene aggiunta direttamente alle cellule in coltura. Le cellule vitali con metabolismo attivo riducono la resazurina a resofurina, che è rosa e fluorescente.

1. Piastre in una piastra a 96 pozzetti precedentemente rivestita con 20 μg/mL di fibronectina e matrice di membrana basale diluita 1:100 in terreni di coltura. Mescolare agitando e poi aggiungere asetticamente Alamar Blue a ciascun pozzetto in una quantità pari al 10% del volume del pozzetto.
2. Incubare le colture con Alamar Blue per 4 ore.
3. Trattare le cellule con il fototrasduttore e il veicolo (DMSO) come descritto in precedenza. Applicare la stimolazione luminosa (luce pulsata a 1 Hz per 1 minuto) attraverso una fibra ottica (ciano, 470 nm) per valutare l'effetto dell'internalizzazione di Ziapin2 e dell'esposizione alla luce sulla vitalità di hiPSC-CM.
4. Lettura della fluorescenza con un lettore di piastre a eccitazione 560 nm ed emissione 590 nm.

5. Valutazione dell'anisotropia del tessuto laminare cardiaco ingegnerizzato

NOTA: Questo protocollo delinea un approccio sistematico per valutare l'anisotropia del tessuto cardiaco laminare ingegnerizzato utilizzando l'immunocolorazione, la microscopia confocale e l'analisi dei nuclei²⁷.

1. Lavare il substrato con PBS più volte prima del fissaggio con paraformaldeide al 4% (v/v) contenente lo 0,05% (v/v) di Triton X-100 in PBS per 10 minuti.
2. Bloccare il legame non specifico incubando campioni con il 5% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) in PBS per 30 minuti.
3. Incubare i campioni con Hoechst (1:500) a temperatura ambiente per 1 ora.
4. Lavare con PBS prima di montare sui vetrini del microscopio con un agente anti-sbiadimento. Lasciare asciugare i vetrini per una notte e conservarli a 4 °C fino all'imaging.
5. Immagini di campioni utilizzando un microscopio confocale a disco rotante con ingrandimento 20x. Determina l'orientamento delle celle utilizzando OrientationJ Measure²⁸, un plug-in FiJi.

6. Registrazioni di mappatura ottica

NOTA: La mappatura ottica è stata eseguita dopo 5 giorni di coltura su hiPSC-CM seminati su chip di tessuto stampati in gelatina.

1. Per seguire questo protocollo, assicurarsi che l'apparato di mappatura ottica sia costituito da un microscopio a lenti tandem modificato dotato di una fotocamera ad alta velocità e dalla sorgente luminosa di eccitazione, una lampada al mercurio da 200 mW. Posizionare uno specchio dicroico davanti alla telecamera di imaging Ca²⁺ designata per garantire che il preparato sia esposto alla luce di eccitazione e per raccogliere la fluorescenza emessa proveniente dal campione.
2. Incubare il campione con 2 μM di X-Rhod 1 aggiunti al terreno di coltura per 30 minuti a 37 °C.
   NOTA: Esporre il campione alla luce solo durante l'acquisizione dell'immagine per evitare il fotosbiancamento del colorante.
3. Incubare il fototrasduttore come precedentemente descritto nel paragrafo 3.
4. Lavare con terreno di coltura fresco e trasferire le patatine in un terreno RPMI 1640 privo di rosso fenolo integrato con B27 meno insulina.
5. Posizionare i chip di tessuto in un piatto a temperatura controllata e avviare le registrazioni a temperatura fisiologica (37 °C), acquisendo immagini a un frame rate di 2,5 fotogrammi/s.
6. Per la stimolazione ottica, applicare la stimolazione ottica puntiforme a un'estremità del tessuto utilizzando una sorgente luminosa a LED (465/25 nm) che consente la stimolazione con Ziapin2. Dosare i tessuti a una frequenza di 0,5 o 1 Hz tramite una fibra ottica temporalmente regolata posizionata a 1 mm di distanza dal tessuto. Per la stimolazione elettrica, applicare una stimolazione puntiforme utilizzando un elettrodo bipolare di platino posizionato al centro dell'estremità più distale del tessuto rettangolare. Questo posizionamento assicura che la propagazione dell'onda Ca²⁺ abbia origine dal punto medio della larghezza del tessuto, che corrisponde al lato più corto del rettangolo. La stimolazione deve essere applicata a una frequenza di 0,5 Hz, con un'ampiezza di 10 V e una durata dell'impulso di 100 ms.
7. Dopo le registrazioni, applica un filtro spaziale con una dimensione di 3 x 3 pixel per migliorare il rapporto segnale/rumore.
8. Determina la velocità di conduzione dell'onda Ca²⁺ ad ogni pixel per ogni impulso, calcolando la velocità di variazione lungo entrambe le direzioni x e y. Per fare ciò, misurare il gradiente spaziale dell'intensità del segnale Ca²⁺ in queste direzioni e metterlo in relazione con il ritardo temporale della propagazione del segnale. Combinando questi tassi di variazione direzionale, quantifica la velocità con cui l'onda viaggia attraverso il campo cellulare in entrambe le dimensioni.

7. Esportazione e gestione dei dati

1. Estrai e analizza i dati con il software di riferimento.
2. Applica un filtro spaziale di 3 x 3 pixel per migliorare il rapporto segnale/rumore.
3. Estrarre le tracce di transitori Ca²⁺ (CaT) come media di una specifica regione di interesse (ROI) selezionata manualmente.
4. Misura i parametri CaT in una regione centrale di interesse (ROI) di 50 x 50 pixel (≈ 25 mm²).
5. Per ogni CaT, analizzare l'ampiezza del CaT, il tempo di salita (_{t peak}), il tempo di massima pendenza del decadimento (Max Decay Slope) e il tempo al 90% di decadimento transitorio (Decay Time₉₀).

8. Analisi statistica

1. Valutare la normalità della distribuzione utilizzando un test statistico appropriato, come un test di normalità, per determinare se devono essere applicati metodi parametrici o non parametrici.
2. Valutare la significatività statistica tra due condizioni utilizzando il test t di Student o il test U di Mann-Whitney rispettivamente per dati continui o categorici. Quando si confrontano più di due gruppi, utilizzare l'ANOVA unidirezionale o il test di Kruskal-Wallis a seconda delle ipotesi dei dati, seguito da appropriati test post-hoc per identificare differenze significative a coppie.

È stato sviluppato e implementato un processo in più fasi per la fabbricazione di tessuto cardiaco laminare ingegnerizzato utilizzando una combinazione di tecniche di modellazione laser, stampaggio della gelatina e semina cellulare. Originariamente stabilita da McCain et ^al.22 e Lee et ^al.24, questa tecnica è stata reimplementata, seguendo i loro protocolli per costruire i microtessuti laminari ingegnerizzati. Il processo integra una pre...

Questo approccio fornisce una solida piattaforma per far progredire la ricerca cardiaca, fornendo approfondimenti sulle complesse dinamiche del tessuto cardiaco, aprendo nuove possibilità per studi meccanicistici cardiaci in vitro a lungo termine che potrebbero potenzialmente portare a nuove strategie terapeutiche. Per garantire il successo di questa metodologia, è fondamentale riprodurre un ambiente microfisiologico che imiti da vicino le condizioni in vivo del cuore...

CB, GL e FL sono gli inventori del brevetto n. "COMPOSTI FOTOCROMATICI". 3802491 del Parlamento europeo (02/07/2020).

Gli autori ringraziano con gratitudine Michael Rosnach per le illustrazioni in Figura 1 e Figura 3, e il Prof. William T. Pu per la fornitura di hiPSC. Questo lavoro è stato supportato dal Consorzio NCATS Tissue Chips (UH3 TR003279) a KKP, dal Ministero dell'Università e della Ricerca attraverso il progetto PRIN 2022 (ID 2022-NAZ-0595) a FL, il progetto PRIN 2020 (ID 2020XBFEMS) a CB e GL e il progetto Fondo Italiano per la Scienza (ID FIS00001244) a GL.