Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Il tratto gastrointestinale (GIT) serve sia nella digestione del cibo che nell'assorbimento dei nutrienti, ma anche come barriera protettiva contro gli agenti patogeni. Tradizionalmente, la ricerca in questo settore si è basata su esperimenti sugli animali, ma c'è una crescente domanda di metodi alternativi che aderiscano ai principi delle 3R: sostituire, ridurre e perfezionare. Gli organoidi suini sono emersi come uno strumento promettente, offrendo una replicazione in vitro più accurata delle condizioni in vivo rispetto ai modelli cellulari tradizionali. Una delle principali sfide con gli organoidi intestinali è la loro superficie apicale rivolta verso l'interno e la superficie basolaterale rivolta verso l'esterno. Questa limitazione può essere superata creando strati di organoidi bidimensionali (2D) su inserti transwell (d'ora in poi denominati inserti), fornendo l'accesso a entrambe le superfici. In questo studio, abbiamo sviluppato con successo colture bidimensionali di digiuno suino e organoidi del colon. Il processo di coltivazione prevede due fasi chiave: in primo luogo, la formazione di un monostrato cellulare, seguita dalla differenziazione delle cellule utilizzando terreni su misura. La crescita cellulare viene monitorata misurando la resistenza elettrica transepiteliale, che si stabilizza entro il giorno 8 per gli organoidi del colon e il giorno 16 per gli organoidi del digiuno. Dopo una fase di differenziazione di 2 giorni, l'epitelio è pronto per l'analisi. Per quantificare e tracciare i processi di trasporto elettrogenico attivo, come la secrezione di cloruro, impieghiamo la tecnica della camera di Ussing. Questo metodo consente la misurazione in tempo reale e la caratterizzazione dettagliata dei processi di trasporto epiteliale. Questo innovativo modello in vitro , combinato con tecniche consolidate come la camera di Ussing, fornisce una solida piattaforma per caratterizzare fisiologicamente il GIT suino all'interno del quadro 3R. Apre inoltre opportunità per lo studio dei meccanismi fisiopatologici e lo sviluppo di potenziali strategie terapeutiche.

Il GIT svolge un ruolo centrale nella digestione, nell'assorbimento dei nutrienti e nell'escrezione dei rifiuti attraverso le feci¹. Inoltre, funziona come barriera contro gli agenti patogeni, un ruolo supportato da una composizione cellulare diversificata, tra cui cellule staminali, cellule caliciformi produttrici di muco, cellule enteroendocrine ed enterociti assorbenti². L'omeostasi intestinale può essere interrotta da vari fattori, come infezioni batteriche³ o processi infiammatori⁴, portando a gravi conseguenze per l'organismo, come malassorbimento, diarrea o addirittura la morte⁵. L'indagine di tali scenari fisiopatologici viene comunemente effettuata utilizzando animali da laboratorio o, in conformità con il principio 3R⁶, colture cellulari derivate da varie specie. La previsione accurata e la trasferibilità dei risultati sono fondamentali quando si utilizzano modelli specie-specifici⁷. Nonostante questa necessità, c'è una notevole carenza di colture cellulari derivate da suini che replichino adeguatamente la complessità e la funzionalità del tratto intestinale.

Per affrontare questa sfida, rilevante anche per altre specie, sono stati sviluppati organoidi tridimensionali (3D) nel tentativo di replicare la complessità fisiologica del GIT⁸. Inizialmente, gli organoidi sono stati creati da intestini umani e di topi; Ad oggi, anche gli organoidi suini provenienti da suini giovani e adulti sono stati sviluppati e coltivati con successo ^9,10. Fin dalla loro nascita, questi organoidi suini sono stati utilizzati in diversi studi, concentrandosi principalmente sulle infezioni intestinali 11,12,13,14. La ricerca volta a caratterizzare le proprietà fisiologiche, come il trasporto dei nutrienti o i processi secretori, rimane limitata¹⁵. Ciò può essere dovuto all'orientamento degli organoidi intestinali, con la superficie apicale rivolta verso l'interno e il lato basolaterale verso l'esterno, limitando l'accessibilità alla superficie apicale. Questa limitazione è stata affrontata coltivando con successo organoidi suini in un formato bidimensionale¹⁶, un metodo che è stato ulteriormente avanzato attraverso l'uso di tessuti congelati per generarli¹⁷.

La coltivazione 2D di organoidi suini fornisce l'accesso a entrambi i lati dell'epitelio, consentendo l'applicazione di metodi consolidati per studiare i processi di trasporto attraverso lo strato epiteliale. Uno di questi metodi è la camera di Ussing¹⁸, che consente l'osservazione in tempo reale dei processi di assorbimento e secrezione elettrogenici attraverso l'epitelio. L'uso estensivo di questo sistema ha fornito una comprensione completa della funzione intestinale suina in vivo, coprendo l'intero asse intestinale. Ciò include studi sul trasporto di monosaccaridi o sul trasporto di acidi grassi a catena corta o risposte a metaboliti vegetali secondari come il resveratrolo che influenzano le caratteristiche di trasporto intestinale 19,20,21,22,23,24. Il consistente corpus di dati provenienti da questi studi facilita il confronto diretto tra le condizioni in vivo ben caratterizzate e l'ambiente in vitro degli organoidi suini, migliorando la nostra comprensione della loro rilevanza fisiologica.

In questo studio, presentiamo un protocollo per la generazione e la coltivazione di monostrati 2D da organoidi suini 3D. Inoltre, dettagliamo l'approccio metodologico per quantificare i processi di trasporto intestinale utilizzando la tecnica della camera di Ussing. Il protocollo offre strumenti per studiare le caratteristiche di assorbimento e secretorie in vitro in organoidi di digiuno e colon, consentendo un confronto diretto con condizioni in vivo ben caratterizzate. Le applicazioni future di questo protocollo potrebbero includere lo studio degli effetti di sostanze farmacologiche o tossicologiche, nonché l'esplorazione delle interazioni tra l'epitelio e i patogeni.

Per questo protocollo, due suini sani (maiale pezzato nero di Bentheim; 1 maschio, 1 femmina; 4,5 mesi; circa 65 kg) sono stati sacrificati mediante sparo di bullone in cattività e sanguinamento. Secondo la legge sulla protezione degli animali, questo (macellazione e rimozione di tessuti) non è classificato come esperimento sugli animali, ma deve essere annunciato all'ufficiale del benessere animale (registrazione n. TiHo-T-2023-15) della Fondazione Università di Medicina Veterinaria di Hannover.

1. Rivestimento degli inserti

NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti con materiali sterili sotto un armadio di sicurezza. Tutte le fasi del protocollo vengono eseguite su ghiaccio se non diversamente specificato.

1. Scongelare la membrana basale congelata su ghiaccio per almeno 1 ora a temperatura ambiente o per una notte sul ghiaccio a 4 °C. Miscelare la membrana basale 1:40 (v/v) con soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata in una provetta conica.
2. Rimuovere le piastre sterili con inserti dalla confezione. Aggiungere 200 μl di miscela di membrana basale allo scomparto apicale di ciascun inserto.
3. Riposizionare il coperchio della piastra a pozzetti e incubare per almeno 1,5 ore a 37 °C, 5% CO₂ in un incubatore.
4. Aspirare accuratamente la soluzione prima di seminare le cellule. Assicurarsi che la punta non tocchi la membrana durante l'aspirazione.

2. Generazione di monostrati di organoidi 2D

NOTA: Gli organoidi del colon suino sono generati e coltivati come descritto per gli organoidi digiunali suini²⁵. Dopo la generazione di organoidi 3D, questi dovrebbero essere coltivati per almeno 3-4 settimane durante il passaggio settimanale per garantire una crescita costante. Il numero di celle all'interno di ciascuna cupola contenenti organoidi 3D, che vengono disciolti nelle fasi successive, è sufficiente a coprire un singolo filtro transmembrana. Prima della generazione del monostrato, gli organoidi 3D sono stati sottoposti a controllo ottico di qualità per verificare la crescita precedente e l'eventuale contaminazione (Figura 1).

Figura 1: Organoidi 3D rappresentativi. Gli organoidi tridimensionali (A) del digiuno e del colon (B) vengono attentamente esaminati al microscopio prima di generare monostrati. Particolare attenzione è rivolta alla valutazione dei modelli di crescita precedenti, dell'integrità strutturale e della presenza di eventuali impurità o contaminazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Rimuovere il terreno organoidico (Tabella 1) dai pozzetti con organoidi cripta 3D. Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciato per pozzetto e sciogliere delicatamente la membrana basale pipettando su e giù con un puntale p1000.
2. Raccogliere tutti gli organoidi disciolti in una provetta da 15 mL pre-riempita con 10 mL di PBS ghiacciato. Centrifugare la provetta a 250 x g, 10 min a 4 °C. Aspirare il surnatante.
3. Risospendere il pellet in 1 mL di tripsina/EDTA calda (37 °C) allo 0,05 % (v/v) (in questa fase è possibile raggruppare 2 provette). Incubare per 5 minuti a 37 °C a bagnomaria e successivamente mettere direttamente sul ghiaccio per fermare la reazione.
4. Risospendere sul ghiaccio 20 volte con la punta p1000 e altre 15 volte con la punta p1000 + la punta p200 in cima. Aggiungere 10 ml di DMEM ghiacciato integrato con il 10% (v/v) di siero fetale di vitello (FCS).
5. Provetta da centrifuga a 1.000 x g, 10 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno monostrato (Tabella 1).
6. Determinare il numero di cellule viventi per mL utilizzando una camera Neubauer secondo le istruzioni del produttore.
7. A questo punto, rimuovere la soluzione di rivestimento dallo scomparto apicale e sostituirla con 500 μl di terreno monostrato caldo (37 °C). Aggiungere 3 mL di terreno monostrato nello scomparto basolaterale.
8. Determinare la resistenza del bianco (TEER) di ciascun inserto vuoto del pozzetto di trasmissione, come descritto in dettaglio nel passaggio 3. Il tempo in cui non è presente alcun mezzo nella camera apicale dovrebbe essere il più breve possibile per evitare che le cellule si secchino.
9. Rimuovere il terreno monostrato apicale e aggiungere per la coltura digiunale 2D 2 x 10⁵ cellule epiteliali e per la coltura 2D del colon 1,5 x 10⁵ cellule epiteliali in 500 μL di terreno monostrato nella camera apicale di ciascun pozzetto.
10. Cambiare il mezzo e misurare TEER ogni 2-3 giorni. Misurare TEER prima di cambiare il fluido. Aspirare con cautela il terreno del compartimento apicale e basale e sostituirlo con 500 μL o 3 mL di terreno fresco e caldo (37 °C).
    1. Per gli organoidi digiuno: il giorno 16, dopo la semina, passare dal terreno monostrato al terreno di differenziazione (Tabella 1). Per gli organoidi del colon: cambiare il terreno il giorno 7 con il mezzo di differenziazione.
11. Cambiare il mezzo di differenziazione ogni giorno ed eseguire la misurazione TEER durante ogni cambio di fluido. Il giorno 18 (per gli organoidi digiunali) o il giorno 9 (per gli organoidi del colon), dopo la semina, procedere con gli esperimenti funzionali.

3. Misura della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)

NOTA: Tutte le misurazioni vengono eseguite in una cabina di sicurezza per evitare contaminazioni. Prima di seminare le celle, ogni pozzetto rivestito vuoto viene misurato per ottenere i valori individuali del bianco. Il volt-ohmmetro memorizza i valori su un dispositivo USB introdotto.

1. Pulire l'elettrodo della bacchetta con etanolo al 70% (v/v) e lasciare asciugare completamente l'elettrodo. Nel frattempo, rimuovere la piastra dall'incubatrice e posizionarla sotto l'armadio.
2. Introdurre il braccio corto dell'elettrodo a bacchetta nello scomparto apicale degli inserti e il braccio lungo nello scomparto basolaterale dell'inserto. Evitare il contatto del braccio corto con lo strato cellulare.
3. Misurare la resistenza elettrica transepiteliale di ciascun pozzetto transepiteliale. Lasciare che il volt-ohmmetro si equilibri per garantire una misurazione stabile. Misurare i valori TEER facendo clic sul pulsante Memorizza.
4. Continuare i passaggi 3.2 e 3.3 con i pozzetti rimanenti. Dopo aver raggiunto l'ultimo pozzo, il volt-ohmmetro apre una richiesta di memorizzazione dei dati su un dispositivo USB. Fai clic su Salva.
5. Pulire l'elettrodo dopo ogni piastra e al termine della misurazione e lasciarlo asciugare completamente prima di riporlo.
6. Sottrarre i valori in bianco determinati prima della semina delle cellule dai valori cellulari misurati.

4. Studi elettrofisiologici di trasporto con la tecnica della camera di Ussing

NOTA: La determinazione degli studi di trasporto elettrofisiologico viene eseguita utilizzando una camera di Ussing costituita da due compartimenti camerali, divisi dall'epitelio. Questa camera è collegata a una pinza di tensione tramite elettrodi Ag/AgCl. Questa tecnica consente di tracciare i processi di trasporto elettrogenico attivo dell'epitelio attraverso le variazioni della corrente di cortocircuito (I_sc) indotta dal voltage clamp e della resistenza tissutale (R_t) calcolata dalla legge di Ohm. I_sc e R_t vengono registrati ogni 6 s durante l'intero esperimento. Durante l'esperimento, il tessuto studiato viene aerato con carbogeno e incubato con soluzioni modificate di Krebs-Henseleit per garantire condizioni vitali. L'indometacina (10 μM) viene aggiunta alle soluzioni tampone per inibire la sintesi delle prostaglandine²⁶.

1. Riscaldare le soluzioni tampone mucosale e sieroso a 37 °C e aerare con carbogeno. Assemblare le singole camere utilizzando un inserto vuoto per ogni singola camera. Assicurarsi che i lati apicali dei pozzetti siano tutti rivolti nella stessa direzione.
2. Riempire tutte le camere con 5 mL di soluzione tampone per mucosa preriscaldata (Tabella 2). Collegare tutti gli elettrodi della pinza di tensione alle singole camere secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che non vi siano bolle di gas che interferiscono con gli elettrodi per garantire una misurazione corretta.
3. Calibrare il software della camera di Ussing con queste condizioni facendo clic sul pulsante Rf/dpI nel software di bloccaggio della tensione. La resistenza di tutti gli inserti vuoti utilizzati deve essere uguale (~ 70 Ohm) e la corrente deve essere di circa 0 mV (± 5 mV). Se questo non è il caso di alcune camere, verificare il corretto posizionamento degli elettrodi o delle bolle nel sistema.
4. Rimuovere tutti gli elettrodi ed eliminare la soluzione tampone usata. Aprire tutte le singole camere e rimuovere gli inserti vuoti. Assicurarsi che l'ordine delle singole camere sia mantenuto.
5. Spostare la piastra a pozzetti con gli inserti dall'incubatore all'armadio di sicurezza. Aspirare con cura il terreno basolaterale e apicale.
6. Lavare le cellule aggiungendo 500 μL di tampone mucoso caldo (37 °C) alla camera apicale e 3 mL di tampone sieroso alla camera basolaterale. Aspirare i tamponi e ripetere 2 volte.
7. Rimuovere gli inserti dalla piastra. Rimuovere delicatamente i supporti degli inserti. Posizionare gli inserti nelle camere di Ussing e assicurarsi che l'orientamento degli inserti sia lo stesso della fase di calibrazione. Assemblare le singole camere come mostrato nella Figura 2.
8. Riempire le camere rivolte verso il lato basolaterale delle cellule con 5 mL di tampone sieroso (Tabella 2) e la camera rivolta verso la camera apicale con 5 mL di tampone per mucosa.
9. Collegare gli elettrodi e i tubi di aerazione a ogni singola camera. Avviare la misurazione nel software Ussing. Lasciare equilibrare per 15 min.
10. Modificare le condizioni da circuito aperto a condizioni di cortocircuito. Equilibrare per 5-10 minuti. Aggiungere 10 μM di forskolina alla camera sierosa.
    NOTA: L'aggiunta di forskolina può essere sostituita da altri agenti/sostanze a seconda dei singoli segmenti intestinali e delle domande di ricerca.
11. Dopo 15 minuti, aggiungere altri agenti allo stesso modo della forskolina o interrompere la misurazione. Rimuovere i tubi di aerazione e gli elettrodi dalle singole camere. Versare le soluzioni tampone di entrambe le camere in una ciotola.
12. Smontare le camere e scartare gli inserti o utilizzarli per analisi di follow-up (ad es. immunoistochimica o analisi di espressione)

Figura 2: Struttura schematica della camera di Ussing. Vengono mostrate entrambe le camere divise dalla membrana con il monostrato 2D cresciuto. Entrambe le camere sono aerate con carbogeno; La tensione e la corrente sono monitorate da due elettrodi per camera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Analisi dei dati generati dall'allestimento della camera di Ussing

1. Importa i dati generati dal software della pinza di tensione in un editor di fogli di calcolo adatto.
2. Per determinare i valori basali I_sc e R_t , calcolare la media di 10 punti dati consecutivi presi 10 minuti dopo l'inizializzazione delle condizioni di cortocircuito. Ogni singola camera funge da replica tecnica, mentre ogni passaggio di organoidi funge da replica biologica.
3. Per valutare gli effetti degli agenti applicati, calcolare la media di 10 punti dati consecutivi immediatamente prima dell'aggiunta dell'agente. Confrontare questa media con il valore massimo (o minimo) osservato dopo l'applicazione dell'agente. I dati ottenuti sono presentati come media ± deviazione standard (SD).

Questo protocollo facilita la generazione affidabile di monostrati 2D suini disaggregando organoidi 3D derivati dal digiuno e dal colon dei suini. Nell'arco di un periodo di coltivazione di 16 giorni per gli organoidi digiuno e di 9 giorni per gli organoidi del colon, si formano monostrati intatti. Questi monostrati possono essere successivamente utilizzati per valutare le proprietà di trasporto elettrogenico e fisiologico utilizzando la tecnica della camera di Ussing.

Questo protocollo descrive un metodo per convertire organoidi 3D suini consolidati in singole cellule, che vengono poi seminate su membrane transwell per formare un monostrato intatto. Questa configurazione garantisce l'accesso al lato apicale delle cellule, facilitando l'uso delle camere di Ussing per monitorare i processi di assorbimento e secrezione.

Il passo iniziale e cruciale in questo processo in più fasi è la precisa disintegrazione degli organoidi 3...

Non abbiamo conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamo il Ministero Federale dell'Alimentazione e dell'Agricoltura (BLE# 28N-2-071-00) per il finanziamento.