JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של אורגנואידים חזיריים שמקורם במעי הדק והגס. הצמיחה של חד-שכבות אלו מסומנת על ידי הגדלת ערכי TEER, המעידים על שלמות אפיתל חזקה. בנוסף, חד-שכבות אלה מציגות תגובות הפרשה פיזיולוגיות בניסויי תא אוסינג לאחר יישום פורסקולין.

Abstract

מערכת העיכול (GIT) משמשת הן לעיכול מזון והן לספיגת חומרים מזינים, אך גם כמחסום מגן מפני פתוגנים. באופן מסורתי, המחקר בתחום זה הסתמך על ניסויים בבעלי חיים, אך יש ביקוש הולך וגובר לשיטות חלופיות הדבקות בעקרונות 3R - החלפה, הפחתה וליטוש. אורגנואידים חזיריים התגלו ככלי מבטיח, המציע שכפול מדויק יותר במבחנה של תנאי in vivo מאשר מודלים תאיים מסורתיים. אתגר מרכזי אחד עם אורגנואידים במעי הוא המשטח האפיקלי הפונה פנימה והמשטח הבסיסי הפונה כלפי חוץ. ניתן להתגבר על מגבלה זו על ידי יצירת שכבות אורגנואידים דו-ממדיות (2D) על תוספות טרנסוול (מכאן ואילך המכונה תוספות), המספקות גישה לשני המשטחים. במחקר זה, פיתחנו בהצלחה תרביות דו-ממדיות של ג'ג'ונום חזירי ואורגנואידים של המעי הגס. תהליך הגידול כולל שני שלבים מרכזיים: ראשית, היווצרות חד-שכבת תאים, ולאחר מכן התמיינות התאים באמצעות מדיה מותאמת. מעקב אחר צמיחת התאים מתבצע על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליתלית, המתייצבת ביום 8 עבור אורגנואידים במעי הגס וביום 16 עבור אורגנואידים של ג'ג'ונום. לאחר שלב התמיינות של יומיים, האפיתל מוכן לניתוח. כדי לכמת ולעקוב אחר תהליכי הובלה אלקטרוגניים פעילים, כגון הפרשת כלוריד, אנו משתמשים בטכניקת תא אוסינג. שיטה זו מאפשרת מדידה בזמן אמת ואפיון מפורט של תהליכי הובלת אפיתל. מודל חדשני זה במבחנה , בשילוב עם טכניקות מבוססות כמו תא האוסינג, מספק פלטפורמה חזקה לאפיון פיזיולוגי של ה-GIT החזירי במסגרת 3R. זה גם פותח הזדמנויות לחקירת מנגנונים פתופיזיולוגיים ולפיתוח אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

Introduction

ה-GIT ממלא תפקיד מרכזי בעיכול, ספיגת חומרים מזינים והפרשת פסולת דרך צואה1. בנוסף, הוא מתפקד כמחסום מפני פתוגנים, תפקיד הנתמך על ידי הרכב תאים מגוון, כולל תאי גזע, תאי גביע המייצרים ריר, תאים אנטרואנדוקריניים ואנטרוציטים סופגים2. הומאוסטזיס במעי יכול להיות מופרע על ידי גורמים שונים, כגון זיהומים חיידקיים3 או תהליכים דלקתיים4, מה שמוביל להשלכות חמורות על האורגניזם, כגון תת ספיגה, שלשול או אפילו מוות5. חקירת תרחישים פתופיזיולוגיים כאלה נעשית בדרך כלל באמצעות חיות מעבדה או, בהתאם לעקרון 3R6, תרביות תאים שמקורן במינים שונים. חיזוי מדויק ויכולת העברה של תוצאות הם חיוניים בעת שימוש במודלים ספציפיים למינים7. למרות הצורך הזה, יש מחסור בולט בתרביות תאים שמקורן בחזירים המשחזרות כראוי את המורכבות והפונקציונליות של מערכת העיכול.

כדי להתמודד עם אתגר זה, הרלוונטי גם למינים אחרים, פותחו אורגנואידים תלת מימדיים (תלת מימדיים) בניסיון לשכפל את המורכבות הפיזיולוגית של GIT8. בתחילה, אורגנואידים נוצרו ממעיים אנושיים ועכברים; עד כה, אורגנואידים חזיריים מחזירים צעירים ובוגרים פותחו וטופחו בהצלחה 9,10. מאז הקמתם, אורגנואידים חזיריים אלה שימשו במספר מחקרים, שהתמקדו בעיקר בזיהומי מעיים 11,12,13,14. מחקר שמטרתו לאפיין תכונות פיזיולוגיות, כגון הובלת חומרים מזינים או תהליכי הפרשה, נותר מוגבל15. ייתכן שהסיבה לכך היא האוריינטציה של אורגנואידים במעי, כאשר המשטח האפיקלי פונה פנימה והצד הבסיסי כלפי חוץ, מה שמגביל את הנגישות למשטח האפיקלי. מגבלה זו טופלה על ידי טיפוח מוצלח של אורגנואידים חזיריים בפורמט דו-ממדי16, שיטה שקודמה עוד יותר באמצעות שימוש ברקמה קפואה כדי לייצר אותם17.

הגידול הדו-ממדי של אורגנואידים חזיריים מספק גישה לשני צידי האפיתל, ומאפשר יישום של שיטות מבוססות היטב לחקר תהליכי הובלה על פני שכבת האפיתל. שיטה אחת כזו היא תא אוסינג18, המאפשר תצפית בזמן אמת על תהליכי ספיגה והפרשה אלקטרוגניים על פני האפיתל. שימוש נרחב במערכת זו סיפק הבנה מקיפה של תפקוד המעי החזירי in vivo, המכסה את כל ציר המעי. זה כולל מחקרים על הובלה או הובלה של חומצות שומן קצרות שרשרת או תגובות למטבוליטים צמחיים משניים כמו רסברטרול המשפיעים על מאפייני הובלת המעיים 19,20,21,22,23,24. גוף הנתונים המשמעותי ממחקרים אלה מאפשר השוואות ישירות בין תנאי in vivo המאופיינים היטב לבין הסביבה החוץ גופית של אורגנואידים חזיריים, ומשפר את הבנתנו את הרלוונטיות הפיזיולוגית שלהם.

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול ליצירה וטיפוח של חד-שכבות דו-ממדיות מאורגנואידים חזיריים תלת-ממדיים. בנוסף, אנו מפרטים את הגישה המתודולוגית לכימות תהליכי הובלת מעיים באמצעות טכניקת תא אוסינג. הפרוטוקול מציע כלים לחקר מאפייני ספיגה והפרשה במבחנה באורגנואידים של ג'ג'ונום ומעי הגס, המאפשרים השוואה ישירה עם תנאי in vivo מאופיינים היטב. יישומים עתידיים של פרוטוקול זה עשויים לכלול חקירת ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים או טוקסיקולוגיים, כמו גם חקירת אינטראקציות בין האפיתל לפתוגנים.

Protocol

לצורך פרוטוקול זה, שני חזירים בריאים (חזיר שחור בנטהיים; זכר אחד, נקבה אחת; בן 4.5 חודשים; כ-65 ק"ג) הוקרבו על ידי ירי בריח בשבי ודימום. על פי חוק צער בעלי חיים, הדבר (שחיטה והוצאת רקמות) אינו מוגדר כניסוי בבעלי חיים אלא יש להודיע על כך לפקיד צער בעלי חיים (מס' רישום). TiHo-T-2023-15) של קרן האוניברסיטה לרפואה וטרינרית בהנובר.

1. ציפוי תוספות

הערה: כל השלבים מתבצעים עם חומרים סטריליים מתחת לארון בטיחות. כל שלבי הפרוטוקול מבוצעים על קרח אם לא צוין אחרת.

  1. הפשירו את קרום המרתף הקפוא על קרח למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר או לילה על הקרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מערבבים את קרום המרתף 1:40 (v/v) עם מי מלח סטריליים קרים כקרח (PBS) בצינור חרוטי.
  2. הסר את הלוחות הסטריליים עם תוספות מהאריזה. הוסף 200 מיקרוליטר של תערובת קרום הבסיס לתא האפיקלי של כל תוספת.
  3. החזר את מכסה צלחת הבאר ודגירה למשך שעה וחצי לפחות בחום של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בחממה.
  4. שאפו את התמיסה בזהירות לפני זריעת התאים. ודא שהקצה אינו נוגע בקרום במהלך השאיפה.

2. יצירת חד-שכבות אורגנואיד דו-ממדיות

הערה: אורגנואידים של המעי הגס החזירי נוצרים ומעובדים כמתואר עבור אורגנואידים חזיריים25. לאחר יצירת אורגנואידים תלת מימדיים יש לגדל אותם לפחות 3-4 שבועות תוך כדי מעבר שבועי כדי להבטיח צמיחה עקבית. מספר התאים בתוך כל כיפה המכילה אורגנואידים תלת מימדיים, המומסים בשלבים הבאים, מספיק כדי לכסות מסנן טרנסממברני יחיד. לפני היצירה החד-שכבתית, האורגנואידים התלת-ממדיים היו נתונים לבקרת איכות אופטית כדי לבדוק את הגידול הקודם ואת הזיהום האפשרי (איור 1).

figure-protocol-1798
איור 1: אורגנואידים תלת-ממדיים מייצגים. אורגנואידים תלת מימדיים (A) jejunum ו-(B) במעי הגס נבדקים בקפידה תחת המיקרוסקופ לפני יצירת חד-שכבות. תשומת לב מיוחדת ניתנת להערכת דפוסי גידול קודמים, שלמות מבנית ונוכחות של זיהומים או זיהום. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הסר את המדיום האורגנואיד (טבלה 1) מהבארות עם אורגנואידים קריפטה תלת מימדיים. הוסף 1 מ"ל PBS קר כקרח לבאר וממיס בעדינות את קרום המרתף על ידי צנרת למעלה ולמטה עם קצה p1000.
  2. אסוף את כל האורגנואידים המומסים בצינור של 15 מ"ל מלא מראש ב-10 מ"ל PBS קר כקרח. צנטריפוגה את הצינור ב-250 x גרם, 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט.
  3. השהה את הגלולה ב-1 מ"ל של טריפסין/EDTA חם (37 מעלות צלזיוס) 0.05% (v/v) (ניתן לאגד 2 צינורות בשלב זה). יש לדגור למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים ולהניח ישירות על קרח לאחר מכן כדי לעצור את התגובה.
  4. תלו על קרח 20x עם קצה p1000, ועוד 15x עם קצה p1000 + קצה p200 למעלה. הוסף 10 מ"ל של DMEM קר כקרח בתוספת 10% (v/v) סרום עגל עוברי (FCS).
  5. צינור צנטריפוגה ב-1,000 x גרם, 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את ה-supernatant והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום חד-שכבתי (טבלה 1).
  6. קבע את מספר התאים החיים למ"ל באמצעות תא נויבאואר בהתאם להוראות היצרן.
  7. הסר את תמיסת הציפוי בשלב זה מהתא האפיקלי והחלף אותה ב-500 מיקרוליטר של מדיום חד-שכבתי חם (37 מעלות צלזיוס). הוסף 3 מ"ל של מדיום חד שכבתי לתא הבסיסי.
  8. קבע את ההתנגדות הריקה (TEER) של כל תוספת Transwell ריקה, כמתואר בפירוט בשלב 3. הזמן שבו אין מדיום בתא האפיקלי צריך להיות קצר ככל האפשר כדי למנוע מהתאים להתייבש.
  9. הסר את המדיום החד-שכבתי האפיקלי והוסף לתרבית הדו-ממדית של הג'ג'ונל 2 x 105 תאי אפיתל ולתרבית הדו-ממדית של המעי הגס 1.5 x 105 תאי אפיתל ב-500 מיקרוליטר של מדיום חד-שכבתי בתא האפיקלי של כל טרנסוול.
  10. החלף מדיום ומדוד TEER כל 2-3 ימים. מדוד TEER לפני החלפת המדיום. שאפו בזהירות את המדיום של התא האפיקלי והבזאלי והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר או 3 מ"ל של מדיום טרי וחם (37 מעלות צלזיוס).
    1. עבור אורגנואידים של ג'ג'ונום: ביום 16, לאחר הזריעה, שנה ממדיום חד-שכבתי למדיום התמיינות (טבלה 1). עבור אורגנואידים במעי הגס: יש לשנות את המדיום ביום השביעי למדיום התמיינות.
  11. שנה את מדיום הבידול מדי יום ובצע מדידת TEER במהלך כל שינוי מדיום. ביום ה-18 (עבור אורגנואידים של ג'ג'ונל) או ביום התשיעי (עבור אורגנואידים במעי הגס), לאחר הזריעה, המשיכו בניסויים פונקציונליים.

3. מדידת התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER)

הערה: כל המדידות מבוצעות מתחת לארון בטיחות כדי למנוע זיהום. לפני זריעת התאים, כל טרנסוול מצופה ריק נמדד כדי לקבל ערכים ריקים בודדים. מד הוולט-אוהם מאחסן ערכים בהתקן USB שהוכנס.

  1. נקו את האלקטרודה עם אתנול 70% (v/v) והניחו לאלקטרודה להתייבש לחלוטין. בינתיים, הוציאו את הצלחת מהחממה והניחו אותה מתחת לארון.
  2. הכניסו את הזרוע הקצרה של אלקטרודת מקלות האכילה לתא האפיקלי של התוספות ואת הזרוע הארוכה לתא הבסיסי של התוספת. הימנע ממגע של הזרוע הקצרה עם שכבת התא.
  3. מדוד את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית של כל טרנסוול. אפשר למד הוולט-אוהם להתאזן כדי להבטיח מדידה יציבה. מדוד ערכי TEER על ידי לחיצה על כפתור החנות.
  4. המשך בשלבים 3.2 ו- 3.3 עם הבארות הנותרות. לאחר שהגיע לבאר האחרונה, מד הוולט-אוהם פותח בקשה לאחסון הנתונים בהתקן USB. לחץ על שמור.
  5. נקו את האלקטרודה לאחר כל צלחת ובסיום המדידה והניחו לה להתייבש לחלוטין לפני האחסון.
  6. הפחיתו ערכים ריקים שנקבעו לפני זריעת התאים מהערכים התאיים הנמדדים.

4. מחקרי הובלה אלקטרופיזיולוגיים בטכניקת תא אוסינג

הערה: קביעת מחקרי הובלה אלקטרופיזיולוגיים מתבצעת באמצעות תא אוסינג המורכב משני תאים תאיים, המחולקים על ידי האפיתל. תא זה מחובר לכרךtagclamp על ידי אלקטרודות Ag/AgCl. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר תהליכי הובלה אלקטרוגניים פעילים של האפיתל באמצעות השינויים בזרם הקצר (Isc) הנגרמים על ידי מהדק המתח וכן התנגדות הרקמות (Rt) המחושבת על ידי חוק אוהם. Isc ו-Rt נרשמים כל 6 שניות במהלך כל הניסוי. במהלך הניסוי הרקמה הנחקרת מאווררת עם קרבוגן ומודגרת בתמיסות קרבס-הנסלייט מותאמות כדי להבטיח תנאים ברי קיימא. אינדומתצין (10 מיקרומטר) מתווסף לתמיסות חיץ כדי לעכב סינתזת פרוסטגלנדין26.

  1. חימום תמיסות חיץ ריריות וסרוזליות ל-37 מעלות צלזיוס ואוורור עם קרבוגן. הרכיבו את התאים הבודדים באמצעות תוספת ריקה לכל תא בודד. ודא שהצדדים האפיקליים של הטרנסבארים פונים כולם לאותו כיוון.
  2. מלאו את כל התאים ב-5 מ"ל של תמיסת חיץ רירית מחוממת מראש (טבלה 2). חבר את כל האלקטרודות מהמתח clamp לתאים הבודדים בהתאם להוראות היצרן. ודא שאין בועות גז מפריעות לאלקטרודות כדי להבטיח מדידה נכונה.
  3. כייל את תוכנת תא ה-Ussing בתנאים אלה על ידי לחיצה על כפתור Rf/dpI בכרךtagמהדק התוכנה. ההתנגדות של כל התוספות הריקות המשומשות צריכה להיות שווה (~ 70 אוהם), והזרם צריך להיות בסביבות 0 mV (± 5 mV). אם זה לא המקרה עבור חדרים מסוימים, בדוק את המיקום הנכון של אלקטרודות או בועות במערכת.
  4. הסר את כל האלקטרודות והשליך את תמיסת החיץ המשומשת. פתח את כל התאים הבודדים והסר את התוספות הריקות. וודאו כי סדר התאים הבודדים נשמר.
  5. העבר את צלחת הבאר עם תוספות מהחממה לארון הבטיחות. שאפו בזהירות את המדיום הבסיסי והאפיקלי.
  6. שטפו את התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר רירי חם (37 מעלות צלזיוס) לתא האפיקלי ו-3 מ"ל של מאגר סרוזלי לתא הבסיסי. שאפו את המאגרים וחזרו על הפעולה פעמיים.
  7. הסר את התוספות מהצלחת. הסר בעדינות את תומכי התוספות. הנח את התוספות בתאי ה-Ussing, וודא שכיוון התוספות זהה לשלב הכיול. הרכיבו את התאים הבודדים כפי שמוצג באיור 2.
  8. מלאו את התאים הפונים לצד הבסיסי של התאים ב-5 מ"ל של מאגר סרוזלי (טבלה 2) ואת החדר הפונה לתא האפיקלי ב-5 מ"ל של מאגר רירי.
  9. חבר את האלקטרודות וצינורות האוורור לכל תא בנפרד. התחל מדידה בתוכנת Uussing. אפשר שיווי משקל למשך 15 דקות.
  10. שנה את התנאים ממעגל פתוח לתנאי קצר. שיווי משקל למשך 5 דקות עד 10 דקות. הוסף 10 מיקרומטר של פורסקולין לתא הסרוסל.
    הערה: תוספת של פורסקולין עשויה להיות מוחלפת בסוכן/חומרים אחרים בהתאם לקטעי מעיים בודדים ולשאלות מחקר.
  11. לאחר 15 דקות, הוסיפו חומרים נוספים באותו אופן כמו פורסקולין או הפסיקו את המדידה. הסר צינורות אוורור ואלקטרודות מתאים בודדים. שופכים את תמיסות החיץ של שני התאים לקערה.
  12. לפרק את התאים ולהשליך את התוספות או להשתמש בהם לניתוח מעקב (למשל, אימונוהיסטוכימיה או ניתוח ביטוי)

figure-protocol-8565
איור 2: מבנה סכמטי של תא האוסינג. מוצגים שני התאים המחולקים על ידי הממברנה עם השכבה הדו-ממדית הגדלה. שני התאים מאווררים עם קרבוגן; מתח וזרם מנוטרים על ידי שתי אלקטרודות לכל תא. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

5. ניתוח נתונים שנוצרו על ידי מערך תא אוסינג

  1. ייבא את הנתונים שנוצרו על ידי תוכנת מהדק המתח לעורך גיליונות אלקטרוניים מתאים.
  2. כדי לקבוע ערכי Isc ו-Rt בזאליים, חשב את הממוצע של 10 נקודות נתונים רצופות שצולמו 10 דקות לאחר אתחול תנאי הקצר. כל תא בודד משמש כהעתק טכני, בעוד שכל מעבר של אורגנואידים משמש כשכפול ביולוגי.
  3. כדי להעריך את ההשפעות של חומרים מיושמים, חשב את הממוצע של 10 נקודות נתונים רצופות מיד לפני הוספת הסוכן. השווה ממוצע זה לערך המקסימלי (או המינימלי) שנצפה לאחר הפעלת הסוכן. הנתונים המתקבלים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD).

תוצאות

פרוטוקול זה מקל על יצירה אמינה של חד-שכבות דו-ממדיות חזיריות על ידי פירוק אורגנואידים תלת-ממדיים שמקורם בג'ג'ונום ובמעי הגס של חזירים. במהלך תקופת טיפוח של 16 יום לאורגנואידים של ג'ג'ונום ו-9 ימים לאורגנואידים במעי הגס, נוצרות חד-שכבות שלמות. לאחר מכן ניתן להשתמש בשכבות חד-ש?...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמרת אורגנואידים תלת-ממדיים של חזירים לתאים בודדים, אשר לאחר מכן נזרעים על ממברנות טרנסוול ליצירת שכבה חד-שכבתית שלמה. תצורה זו מעניקה גישה לצד האפיקלי של התאים, ומקלה על השימוש בתאי Ussing לניטור תהליכי ספיגה והפרשה.

השלב הראשוני והמכ?...

Disclosures

אין לנו שום ניגוד אינטרסים להצהיר עליו.

Acknowledgements

אנו מודים למשרד המזון והחקלאות הפדרלי (BLE# 28N-2-071-00) על המימון.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24 well plateSARSTEDT AG & Co. KG8,33,922
A83-01MedChemExpress, New Jersey, USAHY-10432Store at -20 °C. Thaw when needed
accujet SBrand GmbH + Co KG, Wertheim, Germany26351
Advanced DMEM/F12 MediumThermo Fisher Scientific, Waltham, USA12634010Store at 4 °C
B27 supplementThermo Fisher Scientific, Waltham, USA17504044Store at -20 °C. Thaw when needed
CaCl2.2 H2OMerck KGaA, Darmstadt, GermanyC3306Store at room temperature
D(+)-Glucose (wasserfrei)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.08337Store at room temperature
DAPTMedChemExpress, New Jersey, USAHY-13027Store at -20 °C. Thaw when needed
D-MannitolMerck KGaA, Darmstadt, GermanyM4125Store at room temperature
DMSOSigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany154938Store at room temperature
Electrode-Set (AgCl/PtIr/Std.)Scientific Instruments, Simmerath, Germany#1316
Eppendorf Research plus Eppendorf SE, Hamburg, Gemany3123000063
Eppendorf Research plus Eppendorf SE, Hamburg, Gemany3123000047
EVOM3 Manual Epithelial Volt Ohm MeterWorld precision instruments, Sarasota, USAEVM-MT-03-01
FBSSigma-Aldrich, Schnelldorf, GermanyF7524Store at -20 °C. Thaw when needed
ForskolinSigma-Aldrich, Schnelldorf, GermanyF6886Store at -20 °C. Thaw when needed
gasprofi 1 SCS microWLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Germany60,04,000
Gastrin 1MedChemExpress, New Jersey, USAHY-P1097Store at -20 °C. Thaw when needed
GlutamaxThermo Fisher Scientific, Waltham, USA35050061Store at 4 °C. 
HClSigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany1090571000Store at room temperature
HEPESSigma-Aldrich, Schnelldorf, GermanyH0887Store at 4 °C
Herasafe 2025 Class II Biological Safety CabinetThermo Fisher Scientific, Waltham, USA51033316
Incubator ICO105Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Germany62,20,143
IndomethacinMerck KGaA, Darmstadt, GermanyI7378Store at room temperature
KClMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.04936Store at room temperature
L-GlutaminSigma-Aldrich, Schnelldorf, GermanyG7513Store at -20 °C. Thaw when needed
LWRN Supernatantselfmade Store at -20 °C. Thaw when needed. LWRN supplement is produced according to Miyoshi et al. (2012)
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mLCorning Incorporated - Life Sciences354234Store at -20 °C. Thaw carefully on ice when needed
Megafuge 1.ORHeraeus Instruments, Osterode, Germany75003060
MgCl2.6 H2OMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.05833Store at room temperature
Na2HPO4.2H2OMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.06580Store at room temperature
N-Acetyl-L-cysteineSigma-Aldrich, Schnelldorf, GermanyA7250Store at -20 °C. Thaw when needed
NaClMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.06404Store at room temperature
NaH2PO4.H2OMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.06346Store at room temperature
NaHCO3Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.06329Store at room temperature
Neubauer improved chamberGlaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rhön, Germany40442712
Olympus IX70 iverted MicroscopeOlympus Corporation, Hamburg, Germany
Pen/StrepThermo Fisher Scientific, Waltham, USA15140122Store at -20 °C. Thaw when needed
PolymyxinBSigma-Aldrich, Schnelldorf, GermanyP4932-1MUStore at -20 °C. Thaw when needed
Primovert microscope stand with binocular phototubeZeiss415510-1101-000
rm EGFPrepotech, New Jersey, USA315-09Store at -20 °C. Thaw when needed
SB202190MedChemExpress, New Jersey, USAHY-10295Store at -20 °C. Thaw when needed
Snapwell 3801Corning Incorporated - Life Sciences3801
Trypsin/EDTAThermo Fisher Scientific, Waltham, USA25300054
Ussing Base SystemScientific Instruments, Simmerath, Germany#1317
Ussing Diffusion ChamberScientific Instruments, Simmerath, GermanySKU 1307
Voltage/Current Clamp VCC6Scientific Instruments, Simmerath, GermanySKU 1310
Y27632MedChemExpress, New Jersey, USAHY-10583Store at -20 °C. Thaw when needed

References

  1. Hornbuckle, W. E., Tennant, B. C. . Clinical Biochemistry of Domestic Animals. , 367-406 (1997).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  3. Pham, T. A., Lawley, T. D. Emerging insights on intestinal dysbiosis during bacterial infections. Curr Opin Microbiol. 17 (100), 67-74 (2014).
  4. Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell. 140 (6), 859-870 (2010).
  5. Ternhag, A., Torner, A., Svensson, A., Ekdahl, K., Giesecke, J. Short- and long-term effects of bacterial gastrointestinal infections. Emerg Infect Dis. 14 (1), 143-148 (2008).
  6. Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The principles of humane experimental technique. , (1959).
  7. Zietek, T., Boomgaarden, W. A. D., Rath, E. Drug screening, oral bioavailability and regulatory aspects: A need for human organoids. Pharmaceutics. 13 (8), 1280 (2021).
  8. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  9. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), e66465 (2013).
  10. Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell Tissue Res. 365 (1), 123-134 (2016).
  11. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell Tissue Res. 375 (2), 409-424 (2019).
  12. Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. J Virol. 93 (5), e01682-e01718 (2019).
  13. Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
  14. Yin, L., et al. Aminopeptidase N expression, not interferon responses, determines the intestinal segmental tropism of porcine deltacoronavirus. J Virol. 94 (14), e00480-e00520 (2020).
  15. van der Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Front Cell Dev Biol. 8, 375 (2020).
  16. van der Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Res. 28, 165-171 (2018).
  17. Mussard, E., et al. Culture of piglet intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers. J Vis Exp. (192), e64917 (2023).
  18. Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23 (2-3), 110-127 (1951).
  19. Dengler, F., Kraetzig, A., Gabel, G. Butyrate protects porcine colon epithelium from hypoxia-induced damage on a functional level. Nutrients. 13 (2), 305 (2021).
  20. Guschlbauer, M., et al. Trans-resveratrol and epsilon-viniferin decrease glucose absorption in porcine jejunum and ileum in vitro. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165 (3), 313-318 (2013).
  21. Herrmann, J., Hermes, R., Breves, G. Transepithelial transport and intraepithelial metabolism of short-chain fatty acids (SCFA) in the porcine proximal colon are influenced by SCFA concentration and luminal pH. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 158 (1), 169-176 (2011).
  22. Klinger, S., Breves, G. Resveratrol inhibits porcine intestinal glucose and alanine transport: Potential roles of Na(+)/K(+)-ATPase activity, protein kinase A, AMP-activated protein kinase and the association of selected nutrient transport proteins with detergent resistant membranes. Nutrients. 10 (3), 302 (2018).
  23. Leonhard-Marek, S., Hempe, J., Schroeder, B., Breves, G. Electrophysiological characterization of chloride secretion across the jejunum and colon of pigs as affected by age and weaning. J Comp Physiol B. 179 (7), 883-896 (2009).
  24. Schroeder, B., et al. Preventive effects of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 on acute secretory diarrhea in a pig model of intestinal infection. Dig Dis Sci. 51 (4), 724-731 (2006).
  25. Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), e0256143 (2021).
  26. Ferreira, S. H., Moncada, S., Vane, J. R. Indomethacin and aspirin abolish prostaglandin release from the spleen. Nat New Biol. 231 (25), 237-239 (1971).
  27. Dykstra, G. D., Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Advancements in bovine organoid technology using small and large intestinal monolayer interfaces. J Vis Exp. (208), e67010 (2024).
  28. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  29. Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS One. 16 (10), e0257824 (2021).
  30. Beduneau, A., et al. A tunable Caco-2/HT29-MTX co-culture model mimicking variable permeabilities of the human intestine obtained by an original seeding procedure. Eur J Pharm Biopharm. 87 (2), 290-298 (2014).
  31. Markov, A. G., Veshnyakova, A., Fromm, M., Amasheh, M., Amasheh, S. Segmental expression of claudin proteins correlates with tight junction barrier properties in rat intestine. J Comp Physiol B. 180 (4), 591-598 (2010).
  32. Pearce, S., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19 (2018).
  33. Legen, I., Salobir, M., Kerc, J. Comparison of different intestinal epithelia as models for absorption enhancement studies. Int J Pharm. 291 (1-2), 183-188 (2005).
  34. Moeser, A. J., et al. Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292 (1), G173-G181 (2007).
  35. Moeser, A. J., Ryan, K. A., Nighot, P. K., Blikslager, A. T. Gastrointestinal dysfunction induced by early weaning is attenuated by delayed weaning and mast cell blockade in pigs. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (2), G413-G421 (2007).
  36. Seamon, K. B., Padgett, W., Daly, J. W. Forskolin: unique diterpene activator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (6), 3363-3367 (1981).
  37. Herrmann, J., et al. Segmental diversity of electrogenic glucose transport characteristics in the small intestines of weaned pigs. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 163 (1), 161-169 (2012).
  38. Wright, E. M., Martin, M. G., Turk, E. Intestinal absorption in health and disease--sugars. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 17 (6), 943-956 (2003).
  39. Crane, R. K. Na+ -dependent transport in the intestine and other animal tissues. Fed Proc. 24 (5), 1000-1006 (1965).
  40. Inagaki, A., Yamaguchi, S., Ishikawa, T. Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel currents in surface cells of rat rectal colon. Am J Physiol Cell Physiol. 286 (2), C380-C390 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

3R

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved