Generazione di cloni di cellule T regolatorie umane

Questo protocollo descrive il clonaggio e l'espansione di cellule T regolatorie umane per la generazione di Treg umane vitali ad altissima purezza con demetilazione stabile nella regione demetilata specifica per le Treg (TSDR) e caratteristiche fenotipiche specifiche per le Treg.

Le cellule T regolatorie umane (Treg) sono notoriamente difficili da isolare in elevata purezza dati gli attuali metodi di arricchimento delle Treg. Queste metodiche si basano sull'identificazione delle Treg attraverso diversi marcatori di superficie cellulare attivazione-dipendenti con livelli di espressione variabili in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Le popolazioni isolate come "Treg" contengono quindi spesso un numero considerevole di cellule effettrici non-Treg (ad esempio, Teff) che ostacolano la precisa caratterizzazione fenotipica e funzionale di queste cellule, la loro caratterizzazione genomica e proteomica, la loro enumerazione affidabile in diversi stati di salute e malattia, nonché il loro isolamento ed espansione per scopi terapeutici. Quest'ultimo, in particolare, rimane un grosso ostacolo, poiché l'espansione involontaria dell'homing delle cellule effettrici nei compartimenti cellulari rilevanti per le Treg (ad esempio, le cellule T CD4⁺CD25⁺ ) può rendere l'immunoterapia basata sulle Treg inefficace, o addirittura dannosa. Questo lavoro presenta un metodo che elude i problemi associati all'isolamento e all'espansione delle Treg su base di popolazione e mostra che la generazione di cloni candidati Treg con la successiva selezione, coltura ed espansione di solo cellule monoclonali attentamente controllate, consente la generazione di un prodotto di cellule Treg ultrapure che può essere conservato in coltura per molti mesi. consentire lo studio a valle di queste cellule, anche per possibili applicazioni terapeutiche.

Lo scopo di questo protocollo è quello di consentire la propagazione in vitro di Treg umane clonali di altissima purezza. L'isolamento di popolazioni arricchite con Treg e la successiva clonazione consente la selezione dei fenotipi di Treg desiderati e la loro espansione per ulteriori studi sulla biologia di queste cellule, l'esplorazione della loro potenziale utilità terapeutica e altre applicazioni sperimentali a valle.

La clonazione delle Treg produrrà una purezza delle Treg significativamente migliore rispetto agli approcci di isolamento ed espansione policlonali. Ciò è dovuto all'esclusione affidabile e controllata di cellule effettrici T con fenotipi simili o diversi dalla popolazione purificata, tra cui FOXP3-express (FOXP3^int, CD45RA^negCD25^int) non-Treg e CD4⁺, CD25⁺, FOXP3^- Teff¹, tra gli altri. Le linee cellulari clonali ottenute con questo approccio non affrontano il problema della crescita eccessiva con cloni non-Treg in rapida espansione che rendono praticamente impossibile o almeno estremamente impegnativa l'espansione a lungo termine (cioè diversi mesi) e la coltura in vitro delle cellule. Le Treg clonali consentono anche un ampio controllo delle loro caratteristiche fenotipiche dopo l'espansione, anche attraverso metodi riconosciuti come standard per la valutazione delle caratteristiche epigenetiche indicative delle^{Treg 1,2,3,4} naturali umane in buona fede (ad esempio, demetilazione stabile al TSDR).

L'espansione delle Treg è stata eseguita principalmente sotto forma di espansione di cellule policlonali sia per scopi investigativi che terapeutici ^5,6,7. I problemi con la contaminazione da Teff sono un grave ostacolo al successo dell'implementazione degli approcci immunoterapici basati su cellule Treg. I precedenti tentativi di espandere/generare Treg monoclonali in letteratura sono scarsi e non sono riusciti a dimostrare il mantenimento delle caratteristiche delle Treg a lungo termine⁸.

Questo metodo sarà di interesse per chiunque studi le proprietà cellulari, molecolari e metaboliche delle Treg umane in buona fede . Il prodotto Treg ultrapuro generato attraverso l'utilizzo di questo protocollo, in particolare, si presta ad analisi con approcci genomici. Dati i tassi di espansione relativamente bassi che caratterizzano le Treg umane in generale, questo metodo può essere di utilità limitata per coloro che cercano la rapida espansione di un numero massiccio di cellule. Tuttavia, data l'estrema purezza delle Treg generate con questo protocollo, un numero minore di Treg può avere un'efficacia simile o addirittura migliore rispetto a espansioni più grandi di linee cellulari policlonali che contengono cellule effettrici che limitano il potenziale soppressivo complessivo del prodotto generato.

Questo protocollo segue tutte le linee guida istituzionali relative alla conduzione etica della ricerca che prevede l'uso di campioni umani. Il lavoro con cellule umane e altri prodotti del sangue umano deve avvenire almeno in un ambiente certificato BSL-2 seguendo almeno le linee guida di sicurezza BLS-2.

1. Pre-arricchimento di cellule mononucleate del sangue periferico umano per cellule CD4⁺CD127^loCD25^hi

ATTENZIONE: Utilizzare una tecnica sterile in tutto il testo. Gettare immediatamente gli oggetti taglienti in un contenitore per oggetti taglienti appropriato. Candeggiare tutto ciò che è entrato in contatto con sangue e/o emoderivati prima dello smaltimento. Lavorare in una cabina di biosicurezza.

1. Ottenere sangue periferico umano o emoderivati prearricchiti per leucociti umani (cioè "leucopati") da prelievi di sangue periferico o leucaferesi. Elaborare immediatamente le cellule.
   NOTA: Se non è possibile evitare lo stoccaggio notturno, conservare e trasportare le celle a temperatura ambiente (RT). Evitare l'esposizione al freddo.
2. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) mediante centrifugazione a gradiente su terreno a gradiente di densità come descritto in precedenza⁹.
3. Contare attentamente le PBMC utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule. Se possibile, utilizzare almeno 300 x 10⁶ PBMC per procedere con l'isolamento Treg.
4. Risospendere le PBMC in tampone di isolamento (siero AB umano aggregato al 2% [PHS-AB] con 1,5 mM di EDTA in soluzione salina tamponata con fosfato [PBS]) a una concentrazione di 50 x 10⁶ cellule/mL e procedere con la selezione magnetica secondo le istruzioni del produttore del kit di selezione utilizzato. Ad esempio, utilizzare lo smistamento magnetico delle cellule (Tabella dei materiali) per l'isolamento negativo di una popolazione^{di cellule T CD4+}CD127 lo, seguito dallo smistamento a selezione positiva per le cellule CD25⁺.
   NOTA: Per la purificazione magnetica delle Treg è possibile utilizzare una varietà di prodotti, compresi gli approcci basati su colonne e senza colonne. In alternativa, può essere eseguito il sorting cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) con gating su cellule T CD127^oCD25^CD4+ alte. Tuttavia, la sterilità completa non è possibile con le apparecchiature FACS standard, ponendo un rischio significativo di contaminazione. Inoltre, non si possono escludere lo stress cellulare e i danni conferiti dal sistema fluidico e i laser degli strumenti possono influire sui risultati.
5. Controllare la purezza della popolazione arricchita con Treg risultante attraverso la colorazione per CD4, CD3, CD127 e CD25 (Figura 1). Scegliere un anticorpo CD25 anti-umano che riconosca un dominio di legame CD25 diverso da quello utilizzato nel kit di selezione, come quello specificato nella Tabella dei materiali, per ottenere un risultato accurato. Colorare e fissare le cellule utilizzando un protocollo standard di colorazione superficiale come quello descritto in Nowatzky et ^al.10.

2. Clonazione di Treg da una sospensione di cellule T CD4⁺ umane prearricchite^{CD127 o}CD25^hi

1. Risospendere le cellule^{arricchite con}Treg (CD4⁺CD127 lo CD25^hi) ottenute nella fase 1.4 in terreni a cellule T ([MTC]; RPMI 1640, 5% PHS-AB, 1% streptomicina/penicillina, 1% HEPES, 1% aminoacidi non essenziali e 1% glutammina) con 300 UI/mL di interleuchina-2 ricombinante umana (IL-2) (Tabella dei materiali) con l'obiettivo di una concentrazione di ~1−3 x 10⁶ cellule/mL e contare. Ottenere almeno tre conteggi di celle separati e calcolare il numero medio di cellule prima di procedere perché conteggi accurati sono assolutamente cruciali.
2. Preparare una sospensione di cellule a singola cellula a due concentrazioni: (1) 3 cellule/mL e (2) 6 cellule/mL. Caricare cinque piastre a fondo tondo da 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di sospensione 1 e cinque piastre con sospensione 2. Prestare molta attenzione a mantenere le celle in sospensione durante il caricamento delle piastre per garantire una distribuzione rispettivamente di 0,3 e 0,6 celle/pozzetto.
   NOTA: Non aumentare la concentrazione cellulare a 1 cellula/pozzetto, perché ciò aumenta il rischio di ottenere linee cellulari oligoclonali e non veri cloni.
3. Preparare le cellule feeder da PBMC allogeniche umane appena isolate ottenute attraverso la centrifugazione in gradiente di densità come al punto 1.2.
4. Preparare almeno 10 x 10⁶ cellule di alimentazione per piastra di clonaggio per l'irradiazione risospendendo PBMC allogeniche umane in MTC senza IL-2 in una provetta di polipropilene da 50 mL a una concentrazione di ~10 x 10⁶ PBMC/mL. Chiudere ermeticamente il tubo e irradiare con 35 Gy in un irradiatore gamma o in un dispositivo di irradiazione a raggi X.
   NOTA: L'irradiazione innesca la secrezione di grandi quantità di citochine dagli alimentatori che facilitano la proliferazione di Teff, ma può influenzare negativamente l'espansione delle Treg. Questi verranno successivamente rimossi mediante lavaggio.
5. Centrifugare le celle a 450 x g e RT per 5 minuti dopo l'irradiazione e aspirare il surnatante. Lavare le celle risospendendole in MTC senza IL-2 utilizzando almeno 10 volte il volume della cellula di alimentazione pellettata di terreno/PBS.
   NOTA: Si raccomanda di determinare un profilo di espressione dell'antigene leucocitario umano (HLA) delle cellule del donatore da clonare. Questo può essere fatto attraverso una semplice colorazione per uno o più tipi di HLA che sono comuni nella popolazione da cui deriva un rispettivo donatore (ad esempio, HLA-A2 o HLA-A24). Le PBMC utilizzate come cellule feeder non devono esprimere questo HLA per consentire la reidentificazione/isolamento delle cellule bersaglio dalle colture di espansione prima dell'apoptosi indotta dall'irradiazione degli alimentatori.
6. Risospendere le cellule feeder irradiate e lavate in MTC con 300 UI/mL di IL-2 a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL.
7. Aggiungere fitoemoagglutinina-L (PHA-L) (Tabella dei materiali) a una concentrazione di 4 μg/mL (2 volte la concentrazione richiesta in coltura) e procedere rapidamente alla fase 2.8.
8. Aggiungere 100.000 cellule feeder irradiate in 100 μL di MTC con 4 μg/mL di PHA-L e 300 UI/mL di IL-2 alle cellule arricchite con Treg piastrate, ottenendo un volume totale di 200 μL e una concentrazione di PHA-L di 2 μg/mL in ciascun pozzetto. Mescolare bene pipettando su e giù 5 volte. Limitare il tempo di esposizione delle cellule di alimentazione al PHA-L prima della loro aggiunta alle Treg al minimo indispensabile e mantenerle in sospensione fino alla piastra.
   NOTA: Garantire una concentrazione di PHA-L di 2 μg/mL nella coltura nella fase iniziale di semina, ma utilizzare una concentrazione inferiore, 1 μg/mL dopo la successiva espansione dei cloni Treg. Utilizzare 300 UI/mL di IL-2 in tutta la confezione.
9. Incubare a 37 °C. Sostituire il 50% del terreno utilizzando la MTC con 300 UI/mL di IL-2 ma senza PHA-L nei giorni 5-7.

3. Espansione delle Treg e mantenimento dei cloni in coltura

1. A partire dal giorno 12, controllare le colture per la presenza di pellet di cellule proliferanti.
   NOTA: Ci saranno pellet formati da cellule alimentatrici, ma all'esame microscopico queste appariranno come cellule piccole, rotonde, morenti o morte, mentre le cellule T proliferanti saranno di dimensioni maggiori, con contrasto brillante e aspetto sano, formando spesso gruppi di cellule adiacenti che appaiono marroni all'esame macroscopico.
2. Continua a esaminare le colture ogni 1-2 giorni. Isolare i cloni provvisori proliferanti trasferendoli su singoli pozzetti. Posizionare ogni clone provvisorio su una singola piastra da 96 pozzetti per evitare la contaminazione incrociata di un determinato clone provvisorio o consolidato attraverso il trasferimento involontario di cellule da altri pozzetti.
3. Mantenere le cellule attraverso il 50% di cambi di terreno ogni 2-3 giorni e dividerle secondo necessità. Monitora attentamente le cellule.
   NOTA: Ritardare i cambiamenti dei terreni e la scissione può danneggiare le cellule e la "scissione eccessiva" può arrestare la loro proliferazione e provocare la morte cellulare.
4. Ristimolare le cellule con alimentatori allogenici irradiati come descritto nei passaggi 2.3-2.9, ma utilizzare concentrazioni di PHA-L più basse (ad esempio, 1 μg/mL in MTC con 300 UI/mL di IL-2). Ristimola quando le dimensioni delle cellule diminuiscono e le cellule diventano rotonde invece che ovali allungate che in genere sono dopo 2-3 settimane.
   NOTA: Mantenere la coltura di clonazione originale per almeno 6-8 settimane. Molti dei cloni "precoci" che diventano visibili a 2 settimane o poco dopo tendono a non essere vere Treg, ma cellule non-Treg/Teff a rapida proliferazione e hanno maggiori probabilità di fallire il controllo rispetto alle cellule "tardive", alcune delle quali impiegheranno più di 1 mese per apparire visibilmente in coltura.

4. Verifica dei cloni di Treg provvisori

1. Iniziare il controllo dei cloni provvisori una volta che sono proliferati a ~1 x 10⁶ cellule per la monoclonalità e lo stato di metilazione TSDR.
2. Facoltativamente, è possibile effettuare un prescreening delle espansioni cellulari mediante colorazione per CD3, CD4, CD127 e CD25 al fine di identificare quelli di interesse (ad esempio, CD3⁺CD4⁺CD127^oCD25^hi) per un'ulteriore valutazione (Figura 2).
3. Stabilire la monoclonalità attraverso l'identificazione della presenza di una singola catena Vβ nel prodotto cellulare mediante colorazione Vβ utilizzando set di anticorpi coloranti disponibili in commercio (Tabella dei materiali; Figura 3) seguendo le istruzioni del produttore. Assicurarsi di acquisire almeno 1 x 10⁶ eventi durante l'esecuzione dei campioni su un citometro a flusso per un'analisi affidabile, in modo da poter rilevare popolazioni contaminanti minori. Usa un colorante vitale.
4. Avere lo stato di metilazione del TSDR al locus FOXP3 valutato da fornitori commerciali o internamente^11,12. Ottenere almeno 1 x 10⁵ celle per ottenere risultati adeguati.
5. Una volta confermate l'identità e la clonalità delle Treg nelle fasi 4.3 e 4.4, crioconservare le cellule o utilizzarle per applicazioni a valle.
   NOTA: Approcci di controllo alternativi, ma molto meno affidabili, stanno determinando il fenotipo delle Treg mediante colorazioni FACS ^1,10 e saggi di soppressione in vitro o in vivo^13,14. Evitare di fare eccessivo affidamento sui saggi di soppressione delle Treg¹³. I saggi si basano tipicamente, ma non esclusivamente, sulla cocoltura di Treg in numeri graduati con cellule T responder (cioè PBMC o cellule T purificate, a volte impoverite di Treg) in presenza di cellule presentanti l'antigene di terze parti o CD3/CD28 con diluizione del colorante che rappresenta la proliferazione come read-out. Molti di questi test hanno gravi limitazioni e possono sovrastimare o sottostimare l'effettivo grado di soppressione mediato dalle Treg. Lo stato di metilazione del TSDR rimane la misura più certa/affidabile del fenotipo o "identità" delle Treg3,15,16. Si noti che FOXP3 si trova sul cromosoma X e, nelle femmine, un cromosoma X è inattivato dalla metilazione del DNA, che influenza i risultati dell'analisi di metilazione TSDR.

5. Crioconservazione delle Treg

NOTA: Le Treg possono essere conservate a lungo termine dopo il successo della crioconservazione con DMSO e PHS-AB.

1. Determinare il numero di crioviali necessari per crioconservare le cellule. Questo è uguale al volume finale totale della sospensione cellulare (in mL) da crioconservare, perché 1 mL viene congelato per fiala. Aggiungere un margine di sicurezza del 10% a questo volume per tenere conto delle perdite dovute al pipettaggio/tensione superficiale.
   NOTA: Le cellule possono essere crioconservate a un'ampia gamma di concentrazioni, tipicamente comprese tra 0,1 e 100 x 10 e⁶ cellule/mL.
2. Etichettare i crioviali.
3. Generare la soluzione A (SA): miscelare il 50% di RPMI e il 50% di PHS-AB o plasma umano. Se si utilizza il plasma, centrifugare a 2.000 x g per 20 minuti a 4 °C.
   NOTA: Il volume di SA deve essere pari al 75% del volume finale totale della sospensione cellulare da crioconservare, come determinato al punto 5.1.
4. Generare la soluzione B (SB): miscelare il 60% (v/v) di PBS o RPMI e il 40% (v/v) di dimetilsolfossido (DMSO).
   NOTA: Il volume di SB deve essere pari al 25% del volume finale totale della sospensione cellulare da crioconservare, come determinato al punto 5.1.
5. Raffreddare entrambe le soluzioni a 4 °C.
6. Preparare il mezzo di congelamento mescolando tutto il SB con parti uguali di SA e conservare in ghiaccio.
7. Centrifugare le Treg dal punto 4,5 a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare e scartare il terreno e risospendere le cellule nel SA ghiacciato rimanente e mantenerle in ghiaccio.
8. Aggiungere lentamente il mezzo di congelamento raffreddato 1:1 alle cellule risospese in SA in una grande provetta su ghiaccio agitando la provetta.
9. Aliquotare rapidamente in crioviali a 1 mL/flaconcino. Mettere immediatamente i crioviali in una scatola da armadio a RT e trasferirli in un congelatore a -80 °C senza indugio. Trasferire nel liquido N₂ dopo 24 h.

Il successo dell'implementazione di questo protocollo porterà alla generazione di cloni e linee di cellule T regolatorie umane stabili.

La preselezione/prearricchimento delle cellule CD4⁺CD127 e CD25^hi era un metodo semplice per ottenere una popolazione iniziale che^contenessela maggior parte delle Treg umane (Figura 1A-C). Non tutti i cloni mostravano un fenotipo Treg. Il prescree...

Questo protocollo descrive la propagazione di cellule T regolatorie umane ultrapure attraverso l'isolamento, l'espansione e l'attento controllo di cellule ottenute in un approccio di diluizione limitante e di espansione basato su cellule feeder da popolazioni iniziali contenenti Treg.

I passaggi critici di questo approccio sono: 1) la scelta di una popolazione di partenza appropriata. Generalmente, il compartimento CD127^oCD25^hi delle cell...

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo progetto è stato sostenuto dal National Eye Institute del National Institutes of Health con il numero di premio K08EY025324 (Nowatzky) e da un Colton Scholar Award del Judith and Stewart Colton Center for Autoimmunity (Nowatzky).