Génération de clones de lymphocytes T régulateurs humains

Ce protocole décrit le clonage et l’expansion de lymphocytes T régulateurs humains pour la génération de Treg humains viables de très haute pureté avec une déméthylation stable au niveau de la région déméthylée spécifique des Tregs (TSDR) et des caractéristiques phénotypiques spécifiques des Tregs.

Les lymphocytes T régulateurs humains (Treg) sont notoirement difficiles à isoler avec une grande pureté compte tenu des méthodes actuelles d’enrichissement des Tregs. Ces méthodes sont basées sur l’identification des Treg à l’aide de plusieurs marqueurs de surface cellulaires dépendants de l’activation avec des niveaux d’expression variables dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. Les populations isolées en tant que « Treg » contiennent donc souvent un nombre considérable de cellules effectrices non-Treg (c’est-à-dire Teff) qui entravent la caractérisation phénotypique et fonctionnelle précise de ces cellules, leur caractérisation génomique et protéomique, leur dénombrement fiable dans différents états de santé et de maladie, ainsi que leur isolement et leur expansion à des fins thérapeutiques. Ce dernier, en particulier, reste un obstacle majeur, car l’expansion par inadvertance des cellules effectrices dans les compartiments cellulaires pertinents pour les Treg (par exemple, les lymphocytes T CD4⁺CD25⁺ ) peut rendre l’immunothérapie à base de Treg inefficace, voire nocive. Ce travail présente une méthode qui contourne les problèmes associés à l’isolement et à l’expansion des Treg en population et montre que la génération de clones candidats Treg avec la sélection, la culture et l’expansion ultérieures de cellules monoclonales soigneusement vérifiées, permet la génération d’un produit de cellules Treg ultra-pures qui peut être conservé en culture pendant de nombreux mois. permettant l’étude en aval de ces cellules, y compris pour d’éventuelles applications thérapeutiques.

Le but de ce protocole est de permettre la propagation in vitro de Treg humains clonaux de très haute pureté. L’isolement des populations enrichies en Tregs et le clonage ultérieur permettent de sélectionner les phénotypes Tregs souhaités et de les étendre pour une étude plus approfondie de la biologie de ces cellules, l’exploration de leur utilité thérapeutique potentielle et d’autres applications expérimentales en aval.

Le clonage des Treg produira une pureté des Treg nettement supérieure à celle des approches d’isolement et d’expansion polyclonaux. Cela est dû à l’exclusion fiable et contrôlée des cellules T effectrices ayant des phénotypes similaires ou différents de la population purifiée, y compris les cellules non Treg exprimant FOXP3 (FOXP3^intCD45RA^neg, CD25^int) et CD4⁺ CD25⁺ FOXP3^- Teff¹, entre autres. Les lignées cellulaires clonales obtenues par cette approche ne sont pas confrontées au problème de la prolifération avec des clones non-Treg à expansion rapide qui rendent l’expansion à très long terme (c’est-à-dire plusieurs mois) et la culture in vitro des cellules pratiquement impossibles ou du moins extrêmement difficiles. Les Treg clonaux permettent également un contrôle approfondi de leurs caractéristiques phénotypiques après l’expansion, y compris par des méthodes reconnues comme standard pour l’évaluation des caractéristiques épigénétiques indiquant un Treg 1,2,3,4 naturel humain de bonne foi (par exemple, une déméthylation stable au TSDR).

L’expansion des Treg a principalement été réalisée sous la forme d’une expansion cellulaire polyclonale à des fins d’investigation et thérapeutiques ^5,6,7. Les problèmes de contamination par le teff sont un obstacle majeur à la mise en œuvre réussie des approches d’immunothérapie à base de cellules Treg. Les tentatives précédentes d’expansion/génération de Treg monoclonaux dans la littérature sont rares et n’ont pas réussi à montrer le maintien des caractéristiques des Treg à long terme⁸.

Cette méthode intéressera tous ceux qui étudient les propriétés cellulaires, moléculaires et métaboliques des Treg humains de bonne foi . Le produit Treg ultra-pur généré par l’utilisation de ce protocole se prête notamment à des analyses utilisant des approches génomiques. Étant donné les taux d’expansion relativement faibles qui caractérisent les Treg humains en général, cette méthode peut être d’une utilité limitée pour ceux qui recherchent l’expansion rapide d’un nombre massif de cellules. Cependant, étant donné la pureté extrêmement élevée des Treg générés avec ce protocole, un plus petit nombre de Treg peut avoir une efficacité similaire, voire supérieure, à celle des expansions plus importantes de lignées cellulaires polyclonales contenant des cellules effectrices qui limitent le potentiel suppressif global du produit généré.

Ce protocole suit toutes les lignes directrices institutionnelles relatives à la conduite éthique de la recherche impliquant l’utilisation d’échantillons humains. Le travail avec des cellules humaines et d’autres produits sanguins humains doit avoir lieu au moins dans un environnement certifié BSL-2 en suivant au minimum les directives de sécurité BLS-2.

1. Pré-enrichissement des cellules mononucléées du sang périphérique humain^{pour les cellules} HI CD4⁺CD127^loCD25

ATTENTION : Utilisez une technique stérile tout au long du traitement. Jetez immédiatement les objets tranchants dans un contenant approprié. Blanchir tout ce qui a été en contact avec du sang et/ou des produits sanguins avant de l’éliminer. Travailler dans une enceinte de biosécurité.

1. Obtenir du sang périphérique humain ou des produits sanguins préenrichis pour les leucocytes humains (c.-à-d. « leucocytes ») à partir de prises de sang périphérique ou de leucaphérèse. Traitez les cellules immédiatement.
   REMARQUE : Si le stockage pendant la nuit ne peut être évité, stockez et transportez les cellules à température ambiante (RT). Évitez l’exposition au froid.
2. Isoler les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par centrifugation à gradient sur un milieu à gradient de densité comme décrit précédemment⁹.
3. Comptez soigneusement les PBMC à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules. Si possible, utilisez au moins 300 x 10⁶ PBMC pour procéder à l’isolation des Tregs.
4. Remettre en suspension les PBMC dans un tampon d’isolement (2 % de sérum AB humain mélangé [PHS-AB] avec 1,5 mM d’EDTA dans une solution saline tamponnée au phosphate [PBS]) à une concentration de 50 x 10⁶ cellules/mL et procéder au tri magnétique conformément aux instructions du fabricant du kit de tri utilisé. Par exemple, utilisez le tri magnétique des cellules (Table des matériaux) pour l’isolement négatif d’une population de cellules T CD4⁺CD127^lo , suivi d’un tri par sélection positive pour les cellules CD25⁺ .
   REMARQUE : Une variété de produits peuvent être utilisés pour la purification magnétique des Treg, y compris des approches basées sur colonne et sans colonne. Alternativement, un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) avec contrôle sur les cellules T CD127^loCD25^{à haute} CD4⁺ peut être effectué. Cependant, une stérilité complète n’est pas possible avec un équipement FACS standard, ce qui pose un risque important de contamination. De plus, le stress cellulaire et les dommages conférés par le système fluidique ne peuvent être exclus, et les lasers de l’instrument peuvent avoir un impact sur les résultats.
5. Vérifiez la pureté de la population enrichie en Treg résultante par coloration pour CD4, CD3, CD127 et CD25 (Figure 1). Choisissez un anticorps CD25 anti-humain qui reconnaît un domaine de liaison CD25 différent de celui utilisé dans le kit de tri, comme celui spécifié dans la table des matériaux, pour obtenir un résultat précis. Colorer et fixer les cellules à l’aide d’un protocole standard de coloration de surface tel que celui décrit dans Nowatzky et ^al.10.

2. Clonage de Treg à partir d’une suspension de lymphocytes T CD4+^{humains CD4+} pré-enrichis CD127^loCD25 hi

1. Remettre en suspension les cellules enrichies en Treg (CD4⁺CD127^loCD25^hi) obtenues à l’étape 1.4 dans des milieux de cellules T ([TCM] ; RPMI 1640, 5 % de PHS-AB, 1 % de streptomycine/pénicilline, 1 % d’HEPES, 1 % d’acides aminés non essentiels et 1 % de glutamine) avec 300 UI/mL d’interleukine-2 recombinante humaine (IL-2) (Table des matériaux) visant une concentration de ~1−3 x 10⁶ cellules/mL et compte. Obtenez au moins trois comptages cellulaires distincts et calculez le nombre moyen de cellules avant de continuer, car des comptages précis sont absolument cruciaux.
2. Préparez une suspension unicellulaire de cellules à deux concentrations : (1) 3 cellules/mL et (2) 6 cellules/mL. Chargez cinq plaques à fond rond de 96 puits avec 100 μL/puits de suspension 1 et cinq plaques avec suspension 2. Prenez grand soin de garder les cellules en suspension lors du chargement des plaques pour assurer une distribution de 0,3 et 0,6 cellules/puits, respectivement.
   REMARQUE : N’augmentez pas la concentration cellulaire à 1 cellule/puits, car cela augmente le risque d’obtenir des lignées cellulaires oligoclonales et non de vrais clones.
3. Préparez des cellules nourricières à partir de PBMC allogéniques humains fraîchement isolés obtenus par centrifugation à gradient de densité comme à l’étape 1.2.
4. Préparer au moins 10 x 10⁶ cellules nourricières par plaque de clonage pour l’irradiation en remettant en suspension des PBMC allogéniques humains dans la MTC sans IL-2 dans un tube en polypropylène de 50 mL à une concentration de ~10 x 10⁶ PBMC/mL. Fermez hermétiquement le tube et irradiez avec 35 Gy dans un irradiateur gamma ou un appareil d’irradiation à rayons X.
   REMARQUE : L’irradiation déclenche la sécrétion de grandes quantités de cytokines par les mangeoires qui facilitent la prolifération du Teff, mais peuvent nuire à l’expansion des Tregs. Ceux-ci seront ensuite éliminés par lavage.
5. Centrifuger les cellules à 450 x g et RT pendant 5 min après l’irradiation, et aspirer le surnageant. Lavez les cellules en les remettant en suspension dans la MTC sans IL-2 en utilisant au moins 10 fois le volume de la cellule d’alimentation granulée de milieu/PBS.
   REMARQUE : Il est recommandé de déterminer le profil d’expression de l’antigène leucocytaire humain (HLA) des cellules donneuses à cloner. Cela peut se faire par une simple coloration pour un ou plusieurs types de HLA qui sont courants dans la population dont un donneur respectif est dérivé (c’est-à-dire HLA-A2 ou HLA-A24). Les PBMC utilisées comme cellules nourricières ne doivent pas exprimer ce HLA pour permettre la réidentification/isolement des cellules cibles à partir de cultures d’expansion avant l’apoptose des cellules nourricières induite par l’irradiation.
6. Remettre en suspension les cellules nourricières irradiées et lavées dans la MTC avec 300 UI/mL d’IL-2 à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL.
7. Ajouter la phytohémagglutinine-L (PHA-L) (table des matières) à une concentration de 4 μg/mL (2x la concentration requise en culture) et passer rapidement à l’étape 2.8.
8. Ajoutez 100 000 cellules nourricières irradiées dans 100 μL de MTC avec 4 μg/mL de PHA-L et 300 UI/mL d’IL-2 aux cellules enrichies en Treg, ce qui donne un volume total de 200 μL et une concentration de PHA-L de 2 μg/mL dans chaque puits. Bien mélanger en pipetant de haut en bas 5x. Limitez le temps d’exposition des cellules nourricières au PHA-L avant leur ajout au Treg au strict minimum nécessaire, et maintenez-les en suspension jusqu’à ce qu’ils soient plaqués.
   REMARQUE : S’assurer que la concentration de PHA-L est de 2 μg/mL dans la culture à l’étape initiale de l’ensemencement, mais utiliser une concentration plus faible, de 1 μg/mL, lors de l’expansion subséquente des clones Treg. Utilisez 300 UI/mL d’IL-2 tout au long.
9. Incuber à 37 °C. Changer 50 % du milieu à l’aide de la MTC avec 300 UI/mL d’IL-2, mais sans PHA-L les jours 5 à 7.

3. Expansion des Treg et maintien des clones en culture

1. À partir du jour 12, vérifiez la présence de pastilles de cellules en prolifération dans les cultures.
   REMARQUE : Il y aura des pastilles formées par des cellules nourricières, mais à l’examen microscopique, celles-ci apparaîtront comme de petites cellules rondes, mourantes ou mortes, tandis que les cellules T proliférantes seront de plus grande taille, avec un contraste brillant et un aspect sain, formant souvent des grappes de cellules adjacentes qui apparaissent brunes à l’examen macroscopique.
2. Continuez à examiner les cultures tous les 1 à 2 jours. Isolez les clones provisoires en prolifération en les transférant dans des puits uniques. Placez chaque clone provisoire sur une seule plaque de 96 puits pour éviter la contamination croisée d’un clone provisoire ou établi donné par le biais d’un transfert de cellules par inadvertance à partir d’autres puits.
3. Maintenez les cellules en changeant de milieu à 50 % tous les 2 à 3 jours et divisez-les si nécessaire. Surveillez les cellules de près.
   REMARQUE : Retarder les changements de milieux et la division peut endommager les cellules et la « division excessive » peut arrêter leur prolifération et entraîner la mort cellulaire.
4. Restimulez les cellules avec des allogènes irradiés comme décrit aux étapes 2.3 à 2.9, mais utilisez des concentrations plus faibles de PHA-L (c.-à-d. 1 μg/mL en MTC avec 300 UI/mL d’IL-2). Restimulez lorsque la taille des cellules diminue et que les cellules deviennent rondes, par opposition à l’ovale allongé, ce qui est généralement le cas après 2 à 3 semaines.
   REMARQUE : Conservez la culture de clonage originale pendant au moins 6 à 8 semaines. La plupart des clones « précoces » qui deviennent visibles à 2 semaines ou peu après ont tendance à ne pas être de véritables Treg, mais des cellules non-Treg/Teff à prolifération rapide et sont plus susceptibles d’échouer à l’examen que les cellules « tardives », dont certaines mettront plus d’un mois à apparaître visiblement en culture.

4. Vérification des clones Treg provisoires

1. Commencer à vérifier les clones provisoires une fois qu’ils ont proliféré à ~1 x 10⁶ cellules pour la monoclonalité et le statut de méthylation TSDR.
2. Optionnellement, pré-cribler les expansions cellulaires par coloration pour CD3, CD4, CD127 et CD25 afin d’identifier ceux d’intérêt (c’est-à-dire CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD127^loCD25^hi) pour une évaluation plus approfondie (Figure 2).
3. Etablir la monoclonalité par l’identification de la présence d’une seule chaîne Vβ dans le produit cellulaire par coloration Vβ à l’aide d’ensembles d’anticorps colorants disponibles dans le commerce (Table des matériaux ; Graphique 3) en suivant les instructions du fabricant. Assurez-vous d’acquérir au moins 1 x 10⁶ événements lors de l’analyse d’échantillons sur un cytomètre en flux pour une analyse fiable, afin que les populations contaminantes mineures puissent être détectées. Utilisez un colorant de viabilité.
4. Avoir le statut de méthylation TSDR au locus FOXP3 évalué par des fournisseurs commerciaux ou en interne^11,12. Obtenez au moins 1 x 10⁵ cellules pour des résultats adéquats.
5. Une fois que l’identité et la clonalité des Tregs ont été confirmées aux étapes 4.3 et 4.4, cryoconservez les cellules ou utilisez-les pour des applications en aval.
   REMARQUE : D’autres approches de vérification, mais beaucoup moins fiables, consistent à déterminer le phénotype des Treg par des colorations FACS ^1,10 et des essais de suppression in vitro ou in vivo^13,14. Évitez de trop vous fier aux tests de suppression des Tregs¹³. Les essais sont généralement, mais pas exclusivement, basés sur la coculture de Treg en nombre gradué avec des lymphocytes T répondeurs (c.-à-d. PBMC ou lymphocytes T purifiés, parfois appauvris en Treg) en présence de cellules présentatrices d’antigène tierces ou de CD3/CD28 avec dilution de colorant représentant la prolifération comme lecture. Bon nombre de ces tests ont de graves limites et peuvent surestimer ou sous-estimer le degré réel de suppression médiée par les Treg. Le statut de méthylation de TSDR reste la mesure la plus précise/fiable du phénotype Treg ou « identité »^3,15,16. Notez que FOXP3 est situé sur le chromosome X et, chez les femelles, un chromosome X est inactivé par la méthylation de l’ADN, ce qui affecte les résultats de l’analyse de méthylation TSDR.

5. Cryoconservation des Treg

REMARQUE : Les Treg peuvent être stockés à long terme après une cryoconservation réussie avec DMSO et PHS-AB.

1. Déterminez le nombre de cryoflacons nécessaires pour cryoconserver les cellules. Cela correspond au volume final total de suspension cellulaire (en mL) à cryoconserver, car 1 mL est congelé par flacon. Ajoutez une marge de sécurité de 10 % à ce volume afin de tenir compte des pertes dues au pipetage/à la tension superficielle.
   REMARQUE : Les cellules peuvent être cryoconservées à une large gamme de concentrations, généralement entre 0,1 et 100 x 10⁶ cellules/mL.
2. Étiquetez les cryoflacons.
3. Générer la solution A (SA) : mélanger 50 % de RPMI et 50 % de PHS-AB ou de plasma humain. En cas d’utilisation de plasma, essorage à 2 000 x g pendant 20 min à 4 °C.
   REMARQUE : Le volume d’AS doit être égal à 75 % du volume final total de la suspension cellulaire à cryoconserver, tel que déterminé à l’étape 5.1.
4. Générer la solution B (SB) : mélanger 60 % (v/v) de PBS ou RPMI et 40 % (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO).
   REMARQUE : Le volume de SB doit être de 25 % du volume final total de la suspension cellulaire à cryoconserver, comme déterminé à l’étape 5.1.
5. Réfrigérer les deux solutions à 4 °C.
6. Préparez le fluide de congélation en mélangeant tout le SB avec des parties égales de SA et conservez-le sur de la glace.
7. Faites tourner le Treg à partir de l’étape 4.5 à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirez et jetez le milieu, puis remettez les cellules en suspension dans l’AS glacé restant et conservez-les sur de la glace.
8. Ajoutez lentement le fluide de congélation réfrigéré 1:1 aux cellules remises en suspension dans SA dans un grand tube sur de la glace tout en secouant le tube.
9. Effectuer rapidement l’aliquote dans des cryoflacons à 1 mL/flacon. Placez immédiatement les cryoflacons dans une boîte d’armoire à RT et transférez-les sans délai dans un congélateur à -80 °C. Transférer dans le liquide N₂ après 24 h.

La mise en œuvre réussie de ce protocole conduira à la génération de clones et de lignées de lymphocytes T régulateurs humains stables.

La présélection/pré-enrichissement^{des cellules HI} CD4⁺CD127^loCD25 était une méthode simple pour obtenir une population de départ contenant la plupart des Treg humains (Figure 1A–C). Tous les clones n’ont pas présenté un phénotyp...

Ce protocole décrit la propagation de lymphocytes T régulateurs humains ultrapurs par l’isolement, l’expansion et le contrôle minutieux des cellules obtenues dans une approche de dilution limite et d’expansion basée sur les cellules nourricières à partir de populations de départ contenant des Tregs.

Les étapes critiques de cette approche sont les suivantes : 1) le choix d’une population de départ appropriée. En général, le compartiment CD12...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce projet a été soutenu par le National Eye Institute des National Institutes of Health sous le numéro de prix K08EY025324 (Nowatzky) et par une bourse Colton Scholar du Judith and Stewart Colton Center for Autoimmunity (Nowatzky).