כימות אפנון פעילות אנזים אלסטאז באמצעות אנליזה קולורימטרית

היקף המחקר שלנו מתמקד בפיתוח תרכובות תגובתיות טבעיות. לכן, באמצעות שיטת in vitro, אנו שואפים להעריך את הפעילות של אלסטאז, אנזים המעורב בפירוק של אלסטין ואובדן גמישות, על מנת לשחזר את ההומאוסטזיס של הרקמה. כימות תמציות צמחים טבעיות, הפעילות, מציבה מספר אתגרים, הקשורים בעיקר להרכבם הכימי המורכב וצבעם החזק לעיתים קרובות שיכול להפריע למדידות נפוצות.

פיתוח פרוטוקולים אדפטיביים אמינים חיוני לקידום תחום מחקר זה. המחקר שלנו מציע מספר יתרונות לתחומים, כולל פשטות, רגישות, תוצאה מהירה של מתח, והתאמה לצרכי מחקר שונים. כדי להתחיל, לשקול את הכמות המתאימה של בסיס Tris באמצעות איזון אנליטי ולהעביר את בסיס Tris שוקל לכוסית.

בעזרת גליל מדורג, מוסיפים מים נטולי יונים. ערבבו את התמיסה עם מערבל מגנטי עד להמסה מוחלטת של בסיס הטריס. לאחר מכן התאימו את רמת החומציות של התמיסה לשמונה באמצעות ארבע חומצות הידרוכלוריות רגילות.

לאחר שמגיעים ל- pH הרצוי, מעבירים את התמיסה לצלוחית נפחית. בעזרת מים נטולי יונים, ממלאים את הבקבוק לנפח המסומן. העבירו את המאגר המוכן לבקבוק אחסון מסומן ואחסנו אותו בטמפרטורת החדר.

להכנת הדגימה, שקלול מדויק של כמות הדגימה הנדרשת באמצעות איזון אנליטי. ממיסים את הדגימה במאגר התגובה המוכן כדי להשיג את הריכוז הרצוי. השתמש מערבולת מערבולת כדי להמיס את הדגימה במלואה.

ולאחסן את המדגם מוכן על קרח. לאחר מכן, להכין פתרון עבודה של אנזים אלסטאז בחיץ תגובה לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר. אחסנו את תמיסת האלסטאז על קרח עד שהיא מוכנה לשימוש.

כעת הכינו תמיסת SANA של 0.8 מילימולרית במאגר תגובה. יש להגן על התמיסה מפני אור ולאחסן אותה בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. עבור phenylmethanesulfonyl פלואוריד, או מלאי PMSF, להכין תמיסת PMSF 100 מילימולרית ב isopropanol.

אחסנו את הפתרון המוכן על קרח. הכן את כל התגובות משולש באמצעות צינורות microcentrifuge. לדגור על כל הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע SANA לכל צינור, למעט פקדי הצבע. הפוך בעדינות את הצינורות מספר פעמים כדי לערבב את הדגימות ולהעביר 300 מיקרוליטר מכל צינור לצלחת של 96 בארות, תוך הבטחת מדידות משולשות לכל דגימה. לבסוף, הניחו את הצלחת בעלת 96 הבארות בקורא מיקרו-צלחות המוגדר ל-410 ננומטר, ומדדו את הספיגה מעת לעת, כל דקה במשך 20 דקות, או עד שהאות מתייצב בטמפרטורת החדר.

תמצית אחת הראתה פעילות מעכבת אלסטאז חלשה אך משמעותית בריכוזים של אחד, 0.75 ו-0.5 מיליגרם למיליליטר, ללא השפעה משמעותית של 0.25 מיליגרם למיליליטר. תמצית שתיים הדגימה פעילות מעכבת אלסטאז גבוהה בכל הריכוזים שנבדקו, עם רמות עיכוב דומות לקבוצת הביקורת החיובית באחת, 0.75 ו-0.5 מיליגרם למיליליטר.