השיטה פשוטה יחסית ומאפשרת עריכה גנטית יעילה של תאי Rhesus macaque B. השיטה מאפשרת בדיקה של תאי B ערוכים גנטית למטרות טיפוליות בקופי מקוק רזוס. הוא מתאים גם למחקר פרה-קליני בטיפול בתאי B.
השיטה הכללית עשויה להיות מותאמת לסוגי תאים אחרים. אם ההליך מתבצע כראוי, אין לצפות למאבקים. עם זאת, מכיוון שיעילות חיתוך gRNA ואצווה באיכות טובה של תבנית רקומביננטית המספקת AAV6 הן קריטיות.
כדי להתחיל, לחמם מראש את מדיה תרבית תאי B באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הפשירו את הממריצים של תאי B על קרח. הכינו צינור בגודל מתאים המכיל מצע הפשרה שחומם מראש.
הפשירו בקבוקון אחד או שניים של טחול מקוק רזוס ראשוני או PBMCs באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. דקרו את הטחול לתוך הצינור המוכן המכיל מדיום הפשרה שחומם מראש. שטוף את cryotubes כדי לאסוף את כל התאים.
צנטריפוגה את התאים ב 200 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיום הפשרה לשטיפה. חזור על הצנטריפוגות שלוש פעמים כדי להסיר את התווך המקפיא.
לאחר הצנטריפוגה האחרונה, יש להשהות מחדש את התאים בערך פי חמש פי 10 לששת התאים למיליליטר בתווך תרבית תאי B. שלב 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם 10 מיקרוליטר של 0.4% טריפאן כחול ולספור את התאים על המוציטומטר. התאימו את ריכוז התאים לשלוש פעמים 10 לששת התאים למיליליטר עם מדיום תרבית תאי B בהתאם לספירת התא.
לאחר מכן, הוסיפו את הממריצים של תאי B לריכוזים הסופיים שלהם וערבבו. מעבירים את התאים לצלחת תרבית תאים ודגרים עליהם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות. לאחר ההתיישבות, התאים צריכים ליצור monolayer צפוף אשכולות קטנים של תאים עשויים להיות גלויים כבר.
לאחר כיומיים, התאים צריכים להיות בריאים, לא סדירים, ויצרו אשכולות גדולים יותר באופן ניכר. לאחר הפעלת תאי B, להכין את ריאגנטים אלקטרופורציה ו transduction. חיץ דו-צדדי ללא נוקלאז DMSO טרום חם, חיץ T וחיץ E או E2 מערכת האלקטרופורציה לטמפרטורת החדר.
הפשיר את תבנית התיקון מונחה הומולוגיה rAAV6, או HDRT, וממריצים של תאי B על קרח. השהה מחדש את ה-RNA החד-מנחה CRISPR Cas9, או sgRNA, ב-100 מיקרומולר בחיץ דו-צדדי. יש ליצור מחדש במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולערבב על ידי ערבול והחלקה.
הניחו את ה-sgRNA המשוחזר על קרח עד לשימוש. עבור אלקטרופורציה של 10 מיקרוליטר, הכינו 550 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי B עם ממריצים ו-1% DMSO. הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום זה עם או בלי אנטיביוטיקה לתוך צלחת תרבית תאים 48 באר.
לאחר מכן, הוסף rAAV6 HDRT למדיום הבארות, עד 20% מנפח הבאר. מחממים מראש את המנה המוכנה ונשארים בינוניים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, עבור אלקטרופורציה 10 מיקרוליטר, להכין 1.15 מיקרוליטר של ribonucleoprotein, או RNP, על ידי ערבוב 0.4 מיקרוליטר של 61-micromolar Cas9 עם 0.75 מיקרוליטר של sgRNA 100-micromolar בחיץ דופלקס.
לדגור על RNP במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני ערבוב עם התאים. לאחר הדגירה, ניתן לשלב מספר RNPs אם יש להתמקד ביותר ממוקד אחד בו זמנית. לאחר מכן, להכין את התאים עבור electroporation.
השאירו את התאים בטמפרטורת החדר כדי למנוע זעזועי טמפרטורה. לאחר הדגירה, לקצור את התאים לתוך כלי מתאים. שטפו את הכלי עם DPBS כדי לאסוף את מספר התאים המרבי.
צנטריפוגה את התאים ב 200 גרם במשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-DPBS בערך פי שניים 10 לששת התאים למיליליטר, בהתבסס על מספר התאים שהוכנסו לתרבית. שלב נפחים שווים של תרחיף תאים וכחול טריפאן 0.4% וספור באמצעות המוציטומטר.
לאחר צנטריפוגה והשלכת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את התאים בחיץ T שחומם מראש במהירות של 5.55 כפול 10 לשבעת התאים למיליליטר, בהתבסס על ספירת התאים. הגדר את מערכת הטרנספקציה על ידי הפעלת המכונה והגדרתה ל- 1, 350 וולט, 15 אלפיות השנייה ופעימה אחת. הניחו את תחנת הפיפט בתוך מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית.
עבור כל קבוצה של 10 אלקטרופורציות, להכין צינור transfection עם שלושה מיליליטר של חיץ E.הכנס את הצינור לתחנת פיפטה. שלב 1.15 מיקרוליטר של RNP עם תשעה מיקרוליטר של תאים לכל אלקטרופורציה. הכינו לפחות 20% יותר כדי למנוע בועות ודגרו בטמפרטורת החדר למשך דקה לפני ההתחשמלות.
יש לשאוף 10 מיקרוליטר של RNP ותערובת תאים לתוך קצה האלקטרופורציה על פיפטת אלקטרופורציה. הכנס את פיפטה טעונה לתחנת פיפטה ולהתחיל את electroporation. ודאו שהקצוות נקיים לחלוטין מבועות אוויר כדי למנוע קשתות.
הוציאו מיד את התאים המחושלים לתוך נפח קטן שחומם מראש של מדיום, עם או בלי rAAV6, בתוך באר 48. הוסף דגימות בקרה ללא העברה לבארות התרבית. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך ארבע עד שש שעות.
בתום הדגירה מוסיפים לצלחת 450 מיקרוליטר של תרבית תאי B שחוממה מראש ומכילה חומרים ממריצים, DMSO ועם או בלי אנטיביוטיקה. בצע ניתוח DNA גנומי לאחר 24 שעות. כמת את יעילות העריכה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של פולימראז טיפתי, או PCR, באמצעות פריימר מחוץ לזרוע ההומולוגיה ופריימר בתוך העלון.
ביצוע PCR להגברת אתר ההכנסה וריצוף Sanger לאימות עריכה נכונה. כדי לנתח את רמות החלבון, תרבית את התאים במשך 40 עד 48 שעות לאחר אלקטרופורציה כדי לאפשר שינויים בביטוי החלבונים ולבצע ניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. הייצור של rAAV6 באמצעות עוזר אדנו-ויראלי התומך בטטרציקלין ומשתיק את עצמו הביא לייצור של פי ארבעה פי 10 עד 10 GC למיליליטר של מדיום תרבית תאים, ועלה על הייצור באמצעות טרנספקציה משולשת ללא עוזר פי 30 עד פי 40.
הטיהור האופציונלי הביא לחיסול רוב תאי CD3 + T ותאי CD14 + ו- CD16 + מיאלואיד, עם טוהר של 80 עד 95% תאי CD20 + B המתקבלים באופן שגרתי. עריכה גנטית של תאי Rhesus macaque B ראשוניים מוצגת כאן. מחקר זה שמר על כדאיות תאים גבוהה, ובו זמנית מחק את ביטוי שרשרת האור בתאי 80% B.
רוב תאי B עדיין ביטאו איזוטיפ IgM. התוספת של rAAV6 המקודד את הנוגדן 1485 HDRT הביאה לעריכת גנים ולביטוי פני השטח של נוגדנים 1485 ב-16% עד 21% מתאי B, אם כי בעוצמה פלואורסצנטית נמוכה יותר עבור שרשראות נוגדנים מאשר בתאי B לא ערוכים. תוספת של 1% DMSO ואינקובציות מורחבות ומרוכזות עם rAAV6 HDRT בדרך כלל הגבירו את יעילות העריכה.
באמצעות שיטה זו, בדרך כלל הושגה יעילות עריכה של חמישה עד 20% ועד 40%, בהתאם לקוף מקוק רזוס בודד ואיכות אצוות rAAV6 HDRT. בעת ביצוע האלקטרופורציה, ודא שיש מספיק תערובת עבור transfection ואין בועות בקצה. ניתן לנתח את התאים בכל שיטה רצויה או לבצע העברה אוטולוגית לקוף רזוס התורם.
