פרוטוקול זה מדגים את ההטרוגניות בהרכב, במבנה ובמורפולוגיה של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות, בהתאם לגירוי שלהן בתנאי מבחנה דומים בנויטרופילים אנושיים מאנשים בריאים. טוהר נויטרופילים גבוה וכדאיות מתקבלים. זה מאפשר להשוות את ריכוז הדנ"א, LL-37 ופעילות האנזים של מיאלופרוקסידאז, אלסטאז וקתפסין G, המשתחררים על ידי מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות.
פרוטוקול זה איפשר לנתח את ההשפעה של גורמים מסיסים או מגע תאי או טיפולים או מנגנונים אפשריים לסגירת הייצור של NETs במחלות אוטואימוניות. שיטות אלה יכולות לסייע בחקר מחלות אוטואימוניות. בשל רבייה תאית בלתי מבוקרת של NETs ומשך הזמן של ליישר את המרכיבים שלהם, אשר נחשבים סמנים ביולוגיים של המחלה.
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת ללכוד תמונה של NETs המציגה את פיזור הדנ"א בשיתוף עם חלבונים כגון LL37, אשר ממוקמים יחד עם מיקרואורגניזמים ומסייעים להבין כיצד הם מופיעים. כדי להתחיל, לבצע נקב vena לאסוף 10 מיליליטר של דם היקפי בצינורות המכילים dipotassium EDTA כמו נוגדי קרישה. לאחר מכן בצע ביומטריה סטנדרטית של דם ובדיקת חלבון מגיב C כדי לשלול זיהום או דלקת כדי להבטיח את איכות הדגימה.
צנטריפוגה את דגימת הדם ההיקפית כדי להסיר את הפלזמה העשירה בטסיות, ולאחר מכן צנטריפוגה שנייה ולהשליך את הפלזמה הנותרת. דלל את אריתרוציטים וכתוצאה מכך חבילת לויקוציטים ביחס נפח אחד לאחד עם DPBS אחד 1X. לאחר מכן, בצינור זכוכית סטרילי של 10 מיליליטר, הפקד תחילה מיליליטר אחד של 1.08 גרם לתמיסת צפיפות מיליליטר ואחריו מיליליטר אחד של 1.079 גרם לתמיסת צפיפות מיליליטר.
לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של אריתרוציטים מדולל חבילת לויקוציטים על ידי שפיכה על הקירות. צנטריפוגה ללא האצה או האטה כדי למנוע הפרעה לשיפוע. לשאוף את השלב המתאים גרנולוציטים ולהעביר צינור זכוכית סטרילי אחר 10 מיליליטר.
לשטוף עם ארבעה מיליליטר של 1X DPBS ב 300 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. כדי להסיר את אריתרוציטים הנותרים, לטפל בתאים עם הלם אוסמוטי על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של 0.2% תמיסת מלח. דגירה במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס וצנטריפוגה.
יש להשליך את הסופר-נטנט ולהוסיף ארבעה מיליליטר של תמיסת מלח של 0.65%. דגירה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להחזיר את שלמות הממברנה ולחזור על הצנטריפוגה. הסר את הסופר-נאטנט והשעה מחדש את התאים בארבעה מיליליטר של 1X DPBS כדי להסיר פסולת תאית.
שוב, צנטריפוגה להשעות מחדש את כדור התא בשני מיליליטר של חיץ HBSS קר. כדי לבצע בדיקת הרחקה כחולה טריפאן, יש לדלל חמישה מיקרוליטרים של תרחיף התא ב-20 מיקרוליטרים של 0.4% טריפאן כחול. ספרו את התאים בתא קשת חדש וקבעו את כדאיות התאים באמצעות מבחן אי-הכללה.
לאחר מכן, הרכיבו 5 מיקרוליטרים של מתלה התא על מגלשה והכתימו בכתם של רייט למשך 15 שניות. מיד לתקן את הדגימה, לשטוף עם מים מזוקקים, ולבחון את המורפולוגיה תחת מיקרוסקופ אופטי. לאחר מכן, הוסיפו פעם אחת 10 לתאים החמישיים כדי להזרים צינורות ציטומטריה ולהכתים במיקרוליטר אחד של 7AAD ב-100 מיקרוליטרים של חיץ FACS למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.
יש לשטוף עם 500 מיקרוליטר של מאגר FACS במשקל 300 גרם למשך 10 דקות. לתקן את התאים עם 500 microliters של 2% paraformaldehyde ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד ניתוח ציטומטריה זרימה. לבקרת תאים מתים, לתקן את התאים עם 200 מיקרוליטר של 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות ולשטוף עם 500 microliters של 1XPBS ב 300 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את הסופר-נטנט והוסיפו 200 מיקרוליטרים של 0.1% טריטון X-100. דגירה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף עם 500 מיקרוליטר של 1X PBS ולהכתים עם 7AAD.
נתח את הנתונים שנלכדו בתוכנת ציטומטר הזרימה. טען את הקבצים ולחץ פעמיים על קובץ הנויטרופילים הלא מוכתם. בחר פיזור קדימה או FSC על ציר X ופיזור צדדי או SSC על ציר Y כדי להציג את אוכלוסיית התאים המתאימה לנויטרופילים.
לאחר מכן בחר את הערוץ B3-A:PerCP vio 700-A על ציר X כדי לבטל את ההגבלה האוטומטית של התאים ובחר היסטוגרמה על ציר Y. לאחר מכן, פתח את קובץ הנויטרופילים המוכתם. בחר FSC על ציר X ו- SSC על ציר Y כדי להציג את אוכלוסיית התאים המתאימים לנויטרופילים.
שוב, בחר את הערוץ B3-A:PerCP vio 700-A כדי לתחום את אוכלוסיית הנויטרופילים החיוביים לצבע 7AAD. צור את ההיסטוגרמה הסופית על ידי לחיצה ימנית על החלון ובחירת העתק לעורך הפריסה. הוסף פסאודוהיפאה חיידקית או פטרייתית בצינורות מיקרו של 1.5 מיליליטר.
הוסף 200 מיקרוליטרים, כך שחמישה מיקרומולרים CFSC ב-PBS אחד. מערבבים ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בחושך. עצור את התגובה על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של פלזמה וצנטריפוגה.
השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הכדור במיליליטר אחד של 1XPBS עם צנטריפוגה. לאחר מכן להשעות מחדש את המיקרואורגניזמים ב 250 מיקרוליטר של 1X PBS. הכינו 50 מיקרוליטר אליקוטים במיקרו-צינוריות של 1.5 מיליליטר עם פעמיים 10 לחיידק השביעי או פעמיים 10 לפסאודוהיפאה החמישית להשראת NET.
מניחים 10 על 10 מילימטרים כיסוי זכוכית סטרילי מחליק בלוח של 24 בארות. מכסים עם 10 מיקרוליטרים של 0.001% פולי l-ליזין במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולשטוף פעמיים עם 100 מיקרוליטר של 1X PBS. יש לייבש באוויר ולהקרין אור UV למשך 15 דקות.
לאחר מכן, החלף את תמיסת HBSS של מתלה הנויטרופילים שהוכן קודם לכן במדיום RPMI 1640 בתוספת פלזמה אוטולוגית עם 10% חום. הוסף 350 מיקרוליטרים של תרחיף תא זה לצלחת 24 באר לריכוז סופי של פעמיים 10 לנויטרופילים החמישי לכל באר. דגירה של הצלחת במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית הבארות.
כדי לגרום להיווצרות נטו, הוסיפו את גירויי החיידקים MOI100 ופסאודוהיפאה ב-MOI1. כמו כן להוסיף את הגירויים הביוכימיים ולהכין שליטה ללא גירוי על ידי הוספת 50 microliters של HBSS. להשיג נפח סופי של 400 מיקרוליטר לכל באר ולערבב על שייקר צלחת ב 140 סל"ד במשך 30 שניות.
לאחר מכן דגירה במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר אינדוקציה נטו, הסר את supernatant מן הבארות על ידי pipetting בזהירות לתקן את התאים עם 300 microliters של 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות. לשטוף את התאים עם 200 microliters של 1X PBS ללא צנטריפוגה ולהוסיף 200 microliters של חיץ חוסם במשך 30 דקות.
עבור כתם LL37, יש לחדור לתאים עם 200 מיקרוליטרים של 0.2% טריטון X-100 ב-1X PBS למשך 10 דקות ולשטוף עם 1X PBS פעמיים. הרכב את תלושי הכיסוי על מגלשות זכוכית. הדנ"א מכתים את התאים בשני מיקרוליטרים של DAPI ומאוחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית.
השלבים התאיים הדינמיים הודגמו לאחר טיהור הדרגתי בצפיפות כפולה. המורפולוגיה הנויטרופילית הטיפוסית אושרה על ידי צביעה נכונה. התאים גם הראו כדאיות אופטימלית שנצפתה על ידי הרחקה כחולה טריפאן ללא הפרעה לממברנה.
ניתוח של SSC לעומת FSC על ידי ציטומטריה של זרימה אישר אוכלוסייה המתאימה ל- PMN עם טוהר תאים גבוה. נקודות PMN עבור תאים לא מוכתמים לעומת תאי כתם 7AAD וההיסטוגרמות שלהם בהתאמה הצביעו על כדאיות גבוהה של תאים בנויטרופילים שבודדו זה עתה בהשוואה לתאי הביקורת המחלחלים. לאחר גירוי הנויטרופילים באמצעות ממריצים כימיים ומיקרוביאליים, NETs הודגמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית באמצעות DNA DPI ואנטי-LL37.
המיקרואורגניזמים הוכתמו מראש ב-CFSE. היווצרות רשת אובדנית הנגרמת על ידי PMA המצוינת על ידי לוקליזציה משותפת עם LL37. ואילו NETs שנוצרו עם HOCI הראו פיזור דנ"א מינורי בחלל החוץ-תאי שהתאים להיווצרות NET חיונית.
NET המושרה על ידי פסאודוהיפאה פטרייתית הראתה ריכוזים נמוכים של דנ"א ששוחררו לחלל החוץ-תאי עם מבנים נימה האופייניים להיווצרות NET חיונית. S.aureus הראה היווצרות NET חיונית ואילו P.aeruginosa גרם לשחרור של ריכוזים גדולים של דנ"א עם מורפולוגיה עכורה שהתמקמה עם LL37 המצביעה על היווצרות NET התאבדותית. ביצוע מתודולוגיית שיפוע צפיפות כפולה מאפשר לנו להשיג טוהר גבוה וכדאיות של נויטרופילים.
ואנחנו מרימים את השטיפות, אנחנו נמנעים מפגיעה במבנה שלהן. בעקבות שיטה זו אנו יכולים לנתח את ההשפעה של חומרים או תאים בייצור NET, כמו גם אם הם מעורבים במנגנון כלשהו או בשימוש בהם כטיפולים במחלות אוטואימוניות.
