היום אנחנו רוצים להראות לכם גרסאות של פרוטוקול אחזור אנטיגן הנגרם על ידי חום נפוץ. זה משלב את היתרונות של טמפרטורה נמוכה יותר עבור אנטיגן אלסטאז נויטרופילים וערך pH גבוה הנדרש עבור היסטון. טכניקה זו מאפשרת ללמוד NETs, מלכודות חוץ תאיות נויטרופילים, ברקמות פרפין הן מעכבר או גברים.
וזה גם נחשב ללמוד חומר בארכיון או מחקר רטרוספקטיבי. ראשית, מניחים את השקופיות המוכנות במדפים ומטביעים אותן במדיה המשמשת להתייבשות ולניתוח בסדר הפוך למשך חמש דקות כל אחת. לאחר מכן, מחממים אמבט מים עם צלחת חמה מבוקרת טמפרטורה ל 70 מעלות צלזיוס.
מניחים צנצנת מלאה חיץ אחזור אפיטופ הנגרמת על ידי חום ו 10% גליצרול לתוך אמבט המים. כאשר המאגר הגיע ל-70 מעלות צלזיוס, מקם את ארון התקשורת עם השקופיות לתוך צנצנת המאגר. הדגירה את המגלשות ב 70 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות.
לאחר מכן, להסיר את הצנצנת מן אמבט המים, ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לשטוף את החלקים מקורר שלוש פעמים עם מים מיוננים ופעם אחת עם TBS. באמצעות נייר מסנן מגולגל או ספוגית כותנה, להסיר בזהירות כל נוזל בין החלקים על המגלשות, הקפד להשאיר את החלקים hydrated.
לאחר מכן, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי ליצור מחסום סביב כל קטע. הדגירה את החלק חוצץ חסימה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות כדי למנוע כריכה ספציפית. לדלל את הנוגדנים העיקריים בחסימת חיץ בריכוז של מיקרוגרם אחד למיליליטר.
הסר את מאגר החסימה מהשקופיות והוסף את הנוגדנים הראשיים המדוללים, הקפד להשתמש באמצעי אחסון מספיק כדי למנוע ייבוש. סוגרים את המיכל לח, ו דגירה לילה בטמפרטורת החדר. למחרת, לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם TBS עם כל לשטוף נמשך חמש דקות.
הכן פתרון עבודה של נוגדנים משניים במאגר חסימה. מכסים את חלקי הרקמות בתת פתרון הנוגדנים המשני, ומעבירים את המגלשות למיכל לח. לאטום את המיכל לח, דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
לאחר מכן, לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם TBS ופעם אחת במים עם כל לשטוף שנמשך חמש דקות. מכסים את החלקים השטופים במדיום הרכבה, ומחילים זכוכית כיסוי תוך הימנעות היווצרות בועה. לאחר שמדיום ההרכבה התגבש, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל או במיקרוסקופ שדה רחב עם מסנני מעבר פס מתאימים כדי לנתח את הכשל החיסונו.
כדי להפוך את המקטעים המלאים לדיגיטליים באמצעות סורק שקופיות, הגדר את עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות הפקדים השליליים והחיוביים. באמצעות כתמי אלסטאז נויטרופילים, למצוא את האזורים עשירים נויטרופילים להתקרב על אזורים אלה כדי לבדוק אם אות אלסטאז נויטרופילים הוא פרטני או חוץ תאי. אם האות הוא חוץ תאי וחופף עם כתמי אבן ו- DNA, המלכודות החוץ תאיות נויטרופילים הושגו.
במחקר זה, רכיבי NET מזוהים בהצלחה ברקמה מוטבעת פרפין, הן ממוצא אנושי והן ממוצא מורין. אם חלקי הרקמה יש עובי בין שניים לשלושה מיקרומטרים, הם יכולים להיות מנותחים על ידי מיקרוסקופ שדה רחב באמצעות מטרות 10x או 20x. כדי להעריך נכונה את הכתמים, דגימות שליליות וחיוביות עובדו.
קטע מייצג של רקמת דלקת התוספתן האנושית מראה רקמות מוכתמות NE, H2B, ו Hoechst 33342. התמונות משמאל הן מאזור של החלק המכיל NETs, בעוד התמונות בצד ימין הן מאזור אחר של אותו סעיף המכיל נויטרופילים רבים אך לא NETs. אזורים עם היווצרות נטו מסיבית ניתן למצוא בקלות גם בהגדלות נמוכות מאז כל שלושת רכיבי NET colocalize לעתים קרובות במבנים חוץ תאיים stringy.
פעולה זו מופיעה ב שכבת-על של שלושת הערוצים כסיבים חוץ-תאיים לבנבן שניתן לכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כדי ליצור שכבת-על סגולה באמצעות פיקסלים מאותות חופפים החיוביים לירוק, אדום וכחול. לקבלת רזולוציה גבוהה יותר, מיקרוסקופים קונפוקלים או מיקרוסקופים שדה רחב עם deconvolution יש להשתמש כדי למזער את הטשטוש מחוץ לפוקוס. הקרנה מקסימלית של ערימת קונפוקלים של אזור עשיר ב- NET מאותה דגימת דלקת התוספתן האנושית מראה כי NE נמצא בגרגרי אך הוא גם שופע חוץ תאית שבו הוא colocalizes עם H2B ועם DNA.
קולוקליזציה חוץ-תאית גורמת לשילוב צבעים לבנטני. הפיקסלים החיוביים לירוק, אדום וכחול יכולים לשמש שוב ליצירת שכבת-על סגולה המציגה NETs. פרט מייצג של קטע מרכזי מריאה עכבר נגוע בשחפת Mycobacterium מספק דוגמה נוספת של colocalization של כל שלושת רכיבי NET להיות גלוי בבירור כאזורים לבנבן בין נויטרופילים אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליצור שכבה סגולה המציין NETs.
במהלך הליך הכתם, הסעיפים לא חייבים להתייבש כי זה יגרום כתם חיובי כוזב או רקע גבוה. הניתוח של חומר בארכיון עשוי לעזור להבין את ההשפעה של NETs במחלות. בגלל רקמת פרפין יכול להיות רקע עצום, חשוב לקבל שליטה חיובית ושלילית, כי אתה יכול להבחין בין הכתמים שלך ואת הרקע.
Dewaxing והתייבשות צריך להתבצע תחת מכסה המנוע אדים. הקפד ללבוש כפפות ומעיל המעבדה שלך.
