שיטת הבידוד של תאי גזע המטופויטיים לטווח ארוך וקצר או HSC תסייע לחוקרים להבין טוב יותר את מנגנוני חידוש התאים ואת הבסיס הביולוגי של ההטרוגניות בתא HSC. זוהה גורם שעתוק, Hoxb5, שעשוי להיות סמן בלעדי של HSCs לטווח ארוך. על בסיס זה הוקם קו עכברים של כתב Hoxb5 ובודדו בהצלחה את העכברים לטווח הארוך והקצר.
כדי להתחיל את האוסף של תאי מח עצם תורם, לעקר טיט ו pestle עם 70% אתנול ולתת להם להתייבש לחלוטין. אזנו את אלה עם חיץ מכתים בתאים המורכב מתוספי PBS נטולי סידן ומגנזיום. שים את העצמות שבודדו מעכבר Hoxb5-tri-mCherry זכר תורם במכתש ולהוסיף שלושה מיליליטר של חיץ מכתים התא.
מברישים את העצמות עם המזיק, ואז מפרקים את גושי התאים על ידי פיפטינג עדין ומעבירים את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 100 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר. חזור על התהליך עם חיץ חדש לצביעת תאים עד שהתמיסה מתבהרת. בדרך כלל, חזרה על שלוש פעמים מספיקה כדי להניב פתרון ברור.
לאחר בידוד עצם הירך והטיביה מהעכבר הקונגני CD45.1.2, חותכים את שני קצוות העצמות במספריים סטריליים חדים. בעזרת מחט 23 מד המצוידת במזרק חמישה מיליליטר מלא בחיץ תרחיף תאים קר כקרח, שטפו את מח העצם החוצה לתוך צלחת תרבית תאים סטרילית המכילה חיץ תרחיף תאים. יש לפרק את גושי התאים על ידי פיפטינג עדין, ולאחר מכן לסנן את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון באמצעות פיפטה P1000.
לצורך הגדרת ה-gating, הכינו את הדגימה בהתאם להוראות המופיעות בטקסט, והעבירו 400 מיקרוליטר ממנה למבחנה עגולה מפוליסטירן תחתון עם מכסה הצמדה של מסננת תאים 35 מיקרון. הכן והוסף מגיב מתים לדגימה לפני הניתוח, בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, הפעל את ציטומטר הזרימה והפעל את תוכנת הניתוח בהתאם להוראות היצרן.
לאחר מכן, לחץ על טען כדי להתחיל להשיג את הנתונים. לאחר ניכוי כפילים, תאים מתים ותאים חיוביים לשושלת, שער את השושלת-שלילית, את החלק החיובי-c-kit, Sca-1-חיובי. לאחר מכן, שער את החלק החיובי של Flk2.
לאחר מכן שער Hoxb5-חיובי או Hoxb5-שלילי pHSCs בשבר CD150-חיובי, CD34-שלילי או נמוך. לאחר מכן, הכינו צינור 1.5 מילימטר עם קישור חלבון נמוך עם 600 מיקרוליטר של סידן ומגנזיום PBS, בתוספת 10% FBS מומת חום. כדי לבצע את מיון ה-pHSC החיובי או השלילי של Hoxb5, הגדר את צינור הקישור דל החלבון של 1.5 מיליליטר המוכן במכשיר איסוף מיון ומיין את ה-pHSC החיובי של Hoxb5 או ה-Hoxb5 השלילי לתוך הצינור באמצעות אסטרטגיית ה-gating שהוזכרה קודם לכן.
במיון הראשון, השתמש בתפוקה ממצב דיוק המיון. הגדר את לוח 96 הבארות עם התאים התומכים שהוכנו קודם לכן בשלב יחידת התצהיר האוטומטית של התא. לאחר מכן, הגדר את צינור הקישור דל החלבון של 1.5 מיליליטר ליציאת הטעינה של ציטומטר הזרימה.
מיין את pHSCs חיובי Hoxb5 או Hoxb5 שלילי לתוך צלחת 96 באר עם התאים התומכים באמצעות אסטרטגיית gating שהוזכרה לעיל. מיין 10 pHSCs חיוביים ל-Hoxb5 או Hoxb5-שליליים כדי לבדוק את יכולות ההתחדשות העצמית שלהם. תרשימי ציטומטריית הזרימה של ניתוח מח העצם של עכברי Hoxb5-tri-mCherry התורמים חשפו כ-20% עד 25% מהתאים במקטע pHSC שהוגדר על ידי שושלת שלילית, c-kit-חיובי, Sca-1-חיובי, CD150-חיובי, CD34-שלילי, או נמוך, Flk2-שלילי היו pHSCs חיוביים Hoxb5.
להלן חלקות ציטומטריית הזרימה המייצגות של ניתוח הדם ההיקפי של העכברים המקבלים. יתר על כן, בדיקת הדם ההיקפית של העכברים המושתלים לאחר ההשתלה הראשונית גילתה כי למרות ש- pHSC חיובי ל- Hoxb5 ו- Hoxb5 שלילי הציגו כימריזם דומה של תורם ארבעה שבועות לאחר ההשתלה, המטופויזה מתמשכת נצפתה רק אצל מקבלי pHSC חיובי ל- Hoxb5. HSCs שליליים Hoxb5 החלו לאבד את היכולת לייצר תאים hematopoietic שמונה שבועות לאחר ההשתלה.
בניתוח ההשתלה המשנית, רק מקבלי pHSC חיובי ל-Hoxb5 הציגו המטופויזיס חזק. לעומת זאת, תאי תורם כמעט ולא נצפו בעכברים מושתלי pHSC שליליים של Hoxb5, דבר המצביע על כך שתאי pHSC שליליים של Hoxb5 איבדו את יכולת ההתחדשות העצמית תוך 16 שבועות מההשתלה הראשונית. פרוטוקול זה אורך בדרך כלל תשע עד 12 שעות, ולכן חשוב לשמור על הדגימה בארבע מעלות צלזיוס לאורך כל ההליכים ככל האפשר כדי לשמור על כדאיות התא.
