长期和短期造血干细胞的分离方法

长期和短期造血干细胞或HSC分离方法将有助于研究人员更好地了解HSC区室中细胞更新机制和异质性的生物学基础。鉴定出转录因子Hoxb5，可能是长期HSC的独家标志物。在此基础上，建立了Hoxb5报告小鼠系，并成功分离出长期和短期HSC。

要开始收集供体骨髓细胞，请用70%乙醇对研钵和研杵进行消毒，并让它们完全干燥。用不含钙和镁的PBS补充剂组成的细胞染色缓冲液平衡那些。将从供体雄性Hoxb5-tri-mCherry小鼠中分离的骨头放入研钵中，并加入三毫升细胞染色缓冲液。

用杵刷开骨头，然后通过轻柔移液分解细胞团块，并将细胞悬液通过 100 微米细胞过滤器转移到 50 毫升管中。用新鲜的细胞染色缓冲液重复该过程，直到溶液变得澄清。通常，重复三次就足以产生清晰的解决方案。

从CD45.1.2同源小鼠中分离股骨和胫骨后，用锋利的无菌剪刀切割骨骼的两端。使用装有装有冰冷细胞悬浮缓冲液的 5 毫升注射器的 23 号针头，将骨髓冲洗到含有细胞悬液缓冲液的无菌细胞培养皿中。通过轻柔移液分解细胞团块，然后使用 P1000 移液器通过 40 微米细胞过滤器过滤细胞悬液。

对于浇口设置，按照文本中提供的说明制备样品，并将其转移到带有35微米细胞过滤器卡扣帽的圆底聚苯乙烯试管中。按照制造商的说明，在分析前准备并向样品中添加死细胞菌株试剂。然后，打开流式细胞仪并按照制造商的说明启动分析软件。

然后，按加载开始获取数据。排除双联体、死细胞和谱系阳性细胞后，门禁系阴性、c-kit 阳性、Sca-1 阳性部分。接下来，排除 Flk2 阳性部分。

然后对 CD150 阳性、CD34 阴性或低组分中的 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性 pHSC 进行门控。接下来，准备一个1.5毫米低蛋白结合管，其中含有600微升无钙和镁的PBS，并补充有10%热灭活FBS。要进行Hoxb5阳性或Hoxb5阴性pHSC分选，请将制备的1.5毫升低蛋白结合管放在分选收集装置上，并使用前面提到的门控策略将Hoxb5阳性或Hoxb5阴性pHSC分选到管中。

在第一次排序中，使用排序精度模式的产量。将96孔板与先前制备的支持细胞放在自动细胞沉积单元台上。然后，将1.5毫升低蛋白结合管设置为流式细胞仪的加载口。

使用前面提到的门控策略将Hoxb5阳性或Hoxb5阴性pHSC与支持细胞一起分选到96孔板中。对10个Hoxb5阳性或Hoxb5阴性的pHSC进行分类，以测试它们的自我更新能力。供体Hoxb5-tri-mCherry小鼠骨髓分析的流式细胞术图显示，由谱系阴性，c-kit阳性，Sca-1阳性，CD150阳性，CD34阴性或低Flk2阴性定义的pHSC部分中约有20%至25%的细胞是Hoxb5阳性pHSC。

这里显示的是受体小鼠外周血分析的代表性流式细胞术图。此外，初次移植后受体小鼠的外周血分析显示，尽管Hoxb5阳性和Hoxb5阴性pHSC在移植后四周表现出相似的供体嵌合，但仅在Hoxb5阳性pHSC受者中观察到连续造血。Hoxb5阴性的HSC在移植后八周开始失去产生造血细胞的能力。

在二次移植分析中，只有Hoxb5阳性的pHSC受者表现出强大的造血能力。相比之下，在Hoxb5阴性的pHSC受体小鼠中几乎没有观察到供体细胞，这表明Hoxb5阴性的pHSC在初次移植后16周内失去了自我更新能力。该方案通常需要 9 到 12 小时，因此在整个过程中尽可能将样品保持在 4 摄氏度以保持细胞活力非常重要。