החלת לוציפר צהוב על המדיה של אנטרואידים Apical-out מספקת שיטה פשוטה לניתוח כמותי ואיכותי של כל שלושת מסלולי חדירות המעיים העל-תאיים העיקריים במודל תלת-ממדי. זוהי טכניקה פשוטה יחסית המאפשרת לנו להעריך חדירות באמצעות מודל אנטרואידי. אנו עובדים עם טכניקה זו במחקרים שלנו על דלקת אנטרוקוליטיס נמקית.
עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות שימושית בחקר כל מחלת מעיים אנושית, תוך שימוש במודל אנטרואידי. מי שידגימו את הנהלים היום יהיו חוקרי הפוסט-דוקטורט שלנו, ד"ר טיילר לייבה וד"ר אלנה גולובקובה, כמו גם קמיל שלגל, עוזרת המחקר המפקחת מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, הגדל את מכשירי האנדרואיד המוטמעים ב- BMM למשך שבעה עד 10 ימים עם מדיה מותנית של 50% LWRN עבור הדור האנטרואידי של apical-out או AO.
הסר את המדיה מסביב לכיפות BMM והוסף 500 מיקרוליטרים של תמיסת התאוששות תאים, או CRS לבאר אחת. לגרד את הכיפה, פיפטה אותה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי הומוגניזציה של CRS עם אנטרואידים מוטבע בכיפות BMM, ולהוסיף פתרון זה לבאר הבאה. שוב, לגרד את הכיפה פיפטה אותו למעלה ולמטה מספר פעמים לפני העברת הפתרון לצינור microcentrifuge.
הוסף 500 microliters של CRS לבאר השנייה, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב אותו היטב ולהעביר אותו לבאר הראשונה. מהבאר הראשונה, אחסן את תמיסת ה- BMM האנטרואידית של CRS לתוך אותו צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וחזור על איגום זה עבור הבארות הנותרות עד שתכולת כל הבארות תהיה ב- CRS. מניחים את צינורות המיקרוצנטריפוגה המכילים תמיסת CRS במאגר על מסובב למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן צנטריפוגה את צינור המיקרוצנטריפוגה ב 200 X g במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני הסרת supernatant, והשעיה מחדש את כדור אנטרואיד במיליליטר אחד של 50% LWRN מותנה מדיה. העבר בעדינות 500 מיקרוליטרים של תמיסת האנטרואיד או המדיה התלויה מחדש לכל באר של צלחת תרבית הרקמה 24 הנמוכה במיוחד. דגירה של הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2, במשך שלושה ימים לפני הניסוי.
ודא כי אנטרואידים AO מושעים לפחות 72 שעות לפני השימוש. העבר בעדינות את כל האנטרוידים התלויים במדיה מכל באר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה ב 300 X גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.
הוסף 10 מיקרוליטרים של חמישה מיליגרם למיליליטר של ליפופוליסכריד, או LPS ל-500 מיקרוליטרים של 50% מדיה מותנית LWRN לכל באר כדי להכין את תערובת המאסטר, והשהה מחדש את גלולת האנטרואיד AO מקבוצת הטיפול ל-500 מיקרוליטרים של LPS בתוספת 50% מדיה מותנית LWRN. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. Aliquot 500 microliters של השעיה לתוך כל באר של 24 לוח חיבור נמוך במיוחד.
באופן דומה להשעות מחדש את האנטרוידים של AO מקבוצת הביקורת שלא טופלה ב-500 מיקרוליטרים של 50% LWRN מדיה מותנית לכל באר ו-aliquot 500 מיקרוליטרים של מתלה זה לכל באר של 24 לוחות חיבור נמוכים במיוחד. לגרום היפוקסיה באנטרואידים AO שטופלו ב-LPS באמצעות תא אינקובטור מודולרי עם 1% חמצן, 5% פחמן דו-חמצני ו-94% חנקן, ולדגור על האנטרואידים עם היפוקסיה ו-LPS למשך 24 שעות. מניחים את התרביות הלא מטופלות וה-LPS בתוספת היפוקסיה, באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.
כדי למדוד את החדירות הפארא-תאית באמצעות לוציפר צהוב או LY, העבירו בעדינות את ההשעיה האנטרואידית או המדיה מכל באר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. יש לחמם את מאגר הפוספטים של דולבקו עם מי מלח או DPBS, ומדיה מותנית ב-50% LWRN באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה המתלה ב 300 X גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
הסר את המדיה, ולשטוף את כדור enteroid עם 500 microliters של DPBS חם לפני צנטריפוגה ב 300 X גרם במשך שלוש דקות. הסר את הסופרנטנט עם מיקרו פיפטה וחזור על שלב הכביסה של DPBS פעם נוספת. לאחר שטיפת ה- DPBS, הוסף 450 מיקרוליטרים של מדיה חמה מותנית 50% LWRN, והוסף את המתלים לצלחת באר 24.
לאחר מכן להוסיף 50 microliters של 2.5 מיליגרם לכל מיליליטר LY לכל באר. מערבבים את הצלחת בעדינות כדי לערבב, ומניחים אותה באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים. מכניסים בעדינות את ההשעיה האנטרואידית מכל באר לצינור מיקרוצנטריפוגה.
צנטריפוגה אותו ולהסיר את supernatant משאיר את הכדור enteroid מאחור. לשטוף את הכדור באמצעות 500 microliters של DPBS חם צנטריפוגה אותו. הסר את הסופר-נטנט והשאר את הכדור מאחור.
חזור על שלוש שטיפות של DPBS לפני השעיה מחדש של הכדור עם 1000 מיקרוליטר של DPBS קר, ונתק את האנטרוידים על ידי ערבוב נמרץ באמצעות פיפטה. עבור עקומת התקן הצהוב של לוציפר, הכן את התקנים המדוללים ב- DPBS כמתואר בטקסט. פיפטה 150 מיקרוליטר של כל דגימה לכל באר משולשת על צלחת 96 באר.
מדוד את הפלואורסצנציה בשיא עירור של 428 ננומטר ובשיא פליטה של 536 ננומטר בקורא לוחות פלואורסצנטיים. חשב את הריכוזים באמצעות תוכנה סטטיסטית ועקומת ארבעה פרמטרים המבצעת אינטרפולציה של העקומה הסטנדרטית. צביעה אימונופלואורסצנטית של האנטרואידים התלויים במדיה של 50% LWRN במשך 72 שעות הראתה Zo-1 על המשטח האפיקלי החיצוני של האנטרואיד, בעוד בטא קטנין נראה על פני השטח הבזולטרליים.
הוא הצביע על היפוך הקוטביות הצפוי של אנטרואידים המאשר קונפורמציה AO של אנטרואידים. בזולטרלית החוצה, או אנטרואידים BO שטופלו ב- LPS ובהיפוקסיה הראו חדירות מוגברת באופן משמעותי אשר הודגמה בבדיקת לוציפר צהוב, או LY על ידי ספיגה מוגברת של צבע LY לתוך לומן אנטרואידי, בהשוואה לבקרות שלא טופלו. הבדיקה הצהובה של לוציפר הדגימה גם את הספיגה המוגברת של LY בלומן של אנטרואידים AO מטופלים בהשוואה לבקרות שלא טופלו.
זה אישר את החדירות המוגברת של אנטרואידים AO שטופלו ב- LPS והיפוקסיה, בהשוואה לבקרות שלא טופלו. חשוב לשטוף היטב את הכדורים האנטרואידיים כדי להבטיח שכל ה-LY החוץ-לומינלי יוסר. זה מאפשר כימות מדויק של LY intraluminal הנותרים בחישוב החדירות.
לצורך ניתוח איכותני, ניתן להמחיש אנטרוידים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לקליטת LY לתוך לומן. בעקבות דגירה LY ושלבי השטיפה הבאים לפני התנתקות מקריאת Microplate.
