TB מודה מלגת מחקר מקנדה סיסטיק פיברוזיס.

שים לב מועצת האתיקה מחקר (REB) נדרש לאסוף ולאחסן דגימות כיח מ בבני אדם. מחקרים אלה אושרו על ידי בית החולים לילדים REB # 1000019444. 1. הכנת דוגמאות כיח CF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף מדגם ליחה מחול במהלך ביקורים שיגרתי במרפאת סיסטיק פיברוזיס ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הובלת ליחה המדגם על הקרח במהלך השעה הראשונה של האוסף, למעבדת מחקר, לעבור עיבוד. </li></ol> 2. עיבוד כיח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את עוצמת הקול של מדגם הליחה שהושג. להוסיף בופר פוספט (PBS) כדי 2x היקף המדגם (כלומר, 2 חלקים PBS, מדגם חלק 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדגם היטב עם טפטפת ההעברה. וורטקס המדגם על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 1 דקות לערבב לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1 מ&quot;ל של תערובת הנ&quot;ל לתוך הצינורות מספר 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge המתאים ומסובב ב 5000 XG עבור20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, להסיר את supernatant וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר את supernatant דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאסוף בתוך שפופרת microcentrifuge נקי. הערה: עקרות של תסנין נבחנות על ידי ציפוי על אגרת LB וכך גם ייחס תקשורת נוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן supernatant כיח ב -80 ° C לשימוש עתידי. הערה: כיח מחולים רבים יכולים גם להיות ונקווה לאחר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, לדלל כיח תסנין 1/10 V / V (100 μl של ליחה, 900 μl של תקשורת) בתקשורת רצויה. הערה: כאן, lysogeny מרק סטנדרטי (LB) בתקשורת היה בשימוש. </li></ol> 3. תאיים coverglass שיטה ליצירת biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול לבודד בקטריאלי של לילה עניין התקשורת הרצוי על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (200 סל&quot;ד). הערה: מספר חיידקים שונים שימשו, כולל קליני מבודד Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia מורכבים cepacia ו Achromobacter xylosoxidans. בחירה של תקשורת תלוי זנים ותנאי ריבית, אולם תקשורת LB יכולה לשמש בניסויים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתרבים הלילה, להציב 40 μl של התרבות לתוך 4 מיליליטר של תקשורת הטריה לגדול במשך 3-4 שעות ב 37 ° C עם רועד (200 סל&quot;ד) להשיג תרבות עם צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של כ 0.5 -0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תרבות משלב 3.2 ל 1/5 במדיה הרצויים עם 10% כיח תסנין או ללא תסנין ליחה (כמו שליטה). ריכוז אחר של תסנין כיח ניתן לבדוק (כלומר, 50% או 100%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 200 μl של דילול זרע בארות של תאי שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לחיידקים לצרף במשך 4 שעות ב 37 ° C בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, להסיר את התקשורת לשטוף בעדינות את biofilm עם תקשורת הטריה 1x. חלף עם 200 μl תקשורת טריה. הערה: כדי לחקור את ההשפעות של ליחה על ביופילם, את fresh התקשורת צריכה לכלול supernatant ליחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר biofilms לגדול במשך פרק הזמן הרצוי על 37 מעלות צלזיוס ללא רעד, החלפת התקשורת בכל 12 שעות, בלי לשטוף עד הפעם עבור במיקרוסקופ. הערה: כדי לחקור את ההשפעה של supernatants כיח על רגישות לאנטיביוטיקה ביופילם, אנטיביוטיקה מתווספת המדיה הבאות 24 שעות של צמיחת biofilm ומתוחזקים בתקשורת עד מכתים והדמיה של biofilms. </li></ol> Biofilms מכתים 4. מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זמן צמיחה רצוי (HR 24-48 עובד הכי טוב), להסיר תקשורת מבארת קאמרי לשטוף בעדינות כל תא פעמים עם 300 μl של PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תערובת מכתימה עבור ביופילם על ידי ערבוב 1 μl של כל צבע (המסופק בערכה הכדאית) עבור כל מיליליטר של פתרון הנדרש. הפוך צבע בתמיסת מים או תקשורת. הערה: מים מומלצים על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של תערובת לצבוע היטב כל תאיים coverglass דגירה בטמפרטורת החדר, בחושך במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור תערובת מכתימה מהלשכה ולשטוף היטב עם כל 300 μl של PBS סטרילית. הסר PBS ולהחליף עם מים או תקשורת טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם ויזואליזציה של biofilms באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 5. חזותי Biofilms עם מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא biofilms מוכתם בתאי מיד לאחר מכתים (בתוך שעה 1). מזער את העיכוב להדמיה של השקופיות על ידי צביעת 1 עד 2 תאים 8-גם בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם לייזרים לערכות עירור מסנן עבור הרכישה. הערה: כאן, confocal הדיסק מסתובב המערכת עם לייזרים זוהרים ספקטרלי (גרין: 491nm, אדום: 561 ננומטר) שמשה עירור. סינוני פליטת 515/40 ו 624/40 שמשו כדי להמחיש את הכתמים מתוך ההערכה הכדאית ביופילם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות באמצעות מטרת מי 25x על מיקרוסקופ confocal עם מצלמה. </li><li&gt; השתמש Z- ערימות מנת ליצור מודל של ביופילם. צלמו תמונות בכל 0.5-1 מיקרומטר החל מהמטוס ב-המוקד הראשון למסגרת פוקוס האחרון של ביופילם (בדרך כלל פורש 30-80 מיקרומטר עבור 48 biofilms hr) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 3-5 תמונות מכל טוב. הערה: כך עבור 8 גם מחולק לתאי coverglass, 24-40 תמונות תופקנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תמונות לניתוח. הערה: התמונה צריכה להיות נשמר כמו שת-TIFF קבצים לנתח באמצעות לסטטמ&quot;מ 18,19. הוראות לניתוח תמונה biofilm ניתן למצוא בכתובת http://www.comstat.dk/. ברגע תמונות מיובאות, פרמטרים כגון עובי ממוצע, ביומסה כיסוי שטח לכל ערוץ (אדום וירוק) ניתן לנתח. </li></ol>

<ol>
	<li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+with+biofilm+formation:+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy.">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giving+structure+to+the+biofilm+matrix:+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes.">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li><li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Microbial+coaggregation:+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development.">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation:+a+clinically+relevant+microbiological+process.">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario,+Canada.">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li><li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis.">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li><li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells.">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li><li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa.">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li><li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses.">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).</li><li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li><li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms.">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li><li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients.">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li><li>Vorregaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide.">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).</li></ol>

אף לא אחד.

השיטות שתוארו במסמך זה לאפשר להדמיה של biofilms החיידקים גדל בנוכחות מוצרים אקסוגניים. באופן לא מפתיע, את הייצור של exoproducts הוא בעל חשיבות בעת שימוש בסוג זה של המערכת. למשל, Dithiothreitol (DTT), משמש לעתים קרובות על דגימות כיח אדם לעזור למוסס את הדגימות. עם זאת, ההשפעה של DTT לבדו יכול...

biofilms חיידקים הם קבוצות של מיקרואורגניזמים מחוברים זה לזה עטוף מטריצה-מופרש עצמי. 1,2 קלסי, הם מייצגים חיידקים מחוברים פיזי משטח אביוטי או ביוטיים שנוצר בתנאים של זרימה. Biofilms גם הוכח לגדול בתנאים סטטיים (העדר זרימה) ו דיסטלי ממשטחים, כגון בממשק הנוזל אוויר של ברכות תרמיות או pellicles נוצרו במבחנות. biofilms אלה כבר מזמן מוכר בסביבה והם לרעת משמעותיים בתהליכים תעשייתיים, כפי שהם יכולים להיווצר מאגרי מים או בצינורות, וכתוצאה מכך biofouling, קורוזיה חסימות. 3,4 Biofilms הוא גם קריטי גדרות בריאות, כפי שהם הוכחו להיות מעורבי זיהומים הקשורים קטטר, דלקות ריאות בחולי סיסטיק פיברוזיס, כמו גם זיהומים רבים אחרים. 5,6 אחד מסימני ההיכר של זיהומים ביופילם הוא דהמקומט רגישות של חיידקים לאנטיביוטיקה ולקוי אישור על ידי מערכת החיסון המולדת. 7-9 למדו הכי טוב, תרחישים רלוונטיים קליני מעורבי זיהום מבוסס ביופילם מתרחשים בחולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF), אשר נגועים באופן כרוני עם Pseudomonas aeruginosa biofilms. פ aeruginosa יכול לעבור מספר שינויים במהלך הקמת זיהום כרוני זה עושה את זה קשה מאוד לטיפול. 10,11 Biofilms יכול להפעיל מולדת חסינה ולנסוע דלקת דיפרנציאלי. 12-14 כמו זיהומים אלו מובילים לתחלואה ולתמותה מוגברות בחולי CF, חשוב להבין גורמים שיכולים להשפיע על התפתחות biofilm בהקשר זה. מחקר שנערך לאחרונה עולה כי גורמי מארח הם קריטיים ההיווצרות של אגרגטים ביופילם פ aeruginosa. 15 biofilms אלה תורמים רגישים מופחתים אנטיביוטיקה ומנגנוני הגנה מארחת. preseNCE גורמים מארחים נגזר, כגון אלסטט נויטרופילים, כמו גם מוצרים מופרשים מיקרואורגניזמים נוכחות ריאות CF, יש פוטנציאל לווסת היווצרות והתפתחות ביופילם מאוד. 16 בנוסף, biofilms אינטראקציה עם המארח לווסת ביטוי של מסלולים רבים וליזום דלקת. בעוד שיטות תפוקה גבוהה, כגון assay סגול קריסטל רגיל, יכול לספק קצת מידע לגבי תהליך ביופילם, להדמיה של biofilm בתגובה הגורמים הללו לספק יותר מידע מעמיק. בכתב היד הזה אנו מתארים שיטה לשימוש גורמים מן הליחה של חולי CF כדי ללמוד על ההתפתחות של biofilms במבחנה. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה מהירה של biofilms חשופה לגורמי מארח המכיל כיח באמצעות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות ויזואלית שינויים המתרחשים במהלך צמיחת biofilm בנוכחות exogenoלנו מוצרים, ומייצג שיטה משופרת לנתח את השינויים בפיתוח ביופילם בתנאים שונים.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Blood agar plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>Availble software online</td><td></td><td>COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Millers LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>Standard media for overnight gowth/biofilm growth</td></tr><tr><td>Millex-GV Syringe Filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>Filtering of sputum supernants</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>Washing of biofilm chambers after media removal</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Borealis</td><td>Qs Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td>Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model

Biofilms מורכב קבוצות של חיידקים עטופים מטריצה-מופרש עצמי. הם משחקים תפקיד חשוב זיהום תעשייתי כמו גם בפיתוח וההתמדה של זיהומים רבים הקשורים לבריאות. אחד biofilms תיאר הכי טוב ולמד מחלות אנושיות מתרחשת דלקת ריאות כרונית של חולי סיסטיק פיברוזיס. כאשר לומדים biofilms בהקשר של המארח, גורמים רבים יכולים להשפיע היווצרות והתפתחות ביופילם. על מנת לזהות כיצד גורמי מארח עשויים להשפיע היווצרות ביופילם ופיתוח, השתמשנו בשיטת coverglass חדרים סטטי לגדול biofilms בנוכחות גורמים נגזרים מארחים בצורת supernatants ליחה. חיידקים הם זורעים לתוך תאי וחשוף filtrates ליחה. בעקבות 48 שעות של צמיחה, biofilms מגואלות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית לפני מיקרוסקופיה וניתוח confocal. בעקבות רכישת תמונה, תכונות biofilm ניתן להעריך באמצעות פלטפורמות תוכנה שונות.שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין תכונות מפתח של צמיחת biofilm בנוכחות של חומרים שונים כולל אנטיביוטיקה.

העיצוב הכללי של הניסוי מיוצג באיור 1. השימוש בפרוטוקול זה מספק שיטה נוחה כדי להמחיש את השינויים biofilms גדל במשך תקופות זמן שונות (למשל, 24, 48 או 72 שעות). חשוב לציין, אותות אקסוגניים, כגון ליחה filtrates, ניתן להוסיף כדי להמחיש את השינויים בפיתוח ב...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model at JoVE.com

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

visualizing-effects-sputum-on-biofilm-development-using-chambered

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.3K Views.  Hospital for Sick Children. This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Video: Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

מודל ה- WinCF - מיקרוסקוס הזול והבלתי נסבל של ברונכייל מחובר ריר לחקר המיקרוביולוגיה של זיהומי ריאות

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural integrity. The nosocomial pathogen, Pseudomonas aeruginosa, is known to adopt a biofilm mode of growth, causing chronic pulmonary infection in patients with cystic fibrosis (CF). The computer program, COMSTAT, is a useful tool for quantifying antimicrobial-induced changes in P. aeruginosa biofilm architecture by extracting data from three-dimensional confocal images. However, standardized operation of the software is less commonly addressed, which is important for optimal reporting of biofilm behavior and cross-center comparison. Thus, the aim of this protocol is to provide a simple and reproducible framework for quantifying in vitro biofilm structures under varying antimicrobial conditions via COMSTAT. The technique is modeled using a CF P. aeruginosa isolate, grown in the form of biofilm replicates, and exposed to tobramycin and the anti-Psl monoclonal antibody, Psl0096. The step-by-step approach aims to reduce user ambiguity and minimize the chance of overlooking crucial image-processing steps. Specifically, the protocol emphasizes the elimination of subjective variations associated with the manual operation of COMSTAT, including image segmentation and the selection of appropriate quantitative analysis functions. Although this method requires users to spend additional time processing confocal images prior to running COMSTAT, it helps minimize misrepresented biofilm heterogenicity in automated outputs.

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Antimicrobial-induced changes to Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture differ among clinical isolates cultured from patients with cystic fibrosis and chronic pulmonary infection. Following confocal microscopy, COMSTAT software can be utilized to quantify variations in biofilm architecture (e.g., surface area, thickness, biomass) for individual isolates to assess the efficacy of anti-infective agents.

כימות ההשפעות של אנטי-מיקרוביאלים על ארכיטקטורת ביופילם במבחנה באמצעות תוכנת COMSTAT

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

בדיקות יעילות אנטיביוטית במודל אקס ויוו של פסאודומונס aeruginosa ו Staphylococcus aureus Biofilms בריאה סיסטיק פיברוזיס

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

<meta charset="utf8"></head><body>מודל CF ניתן להתאמה לבדיקות אנטי-מיקרוביאליות וניתוח דינמיקה מיקרוביאלית

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד

מתודולוגיות לימוד

מודל ה- WinCF - מיקרוסקוס הזול והבלתי נסבל של ברונכייל מחובר ריר לחקר המיקרוביולוגיה של זיהומי ריאות

כימות ההשפעות של אנטי-מיקרוביאלים על ארכיטקטורת ביופילם במבחנה באמצעות תוכנת COMSTAT

בדיקות יעילות אנטיביוטית במודל אקס ויוו של פסאודומונס aeruginosa ו Staphylococcus aureus Biofilms בריאה סיסטיק פיברוזיס

פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס