אחד המחסומים המשמעותיים בחקר שומן תוך שרירי, סימן היכר של סרקופניה ומחלות נוירומוסקולריות, הוא שימור יעיל והדמיה לאחר מכן של אדיפוציטים, במיוחד בקטעי רקמות קפואות. הפרוטוקול משמר מורפולוגיה של אדיפוציטים ומקטעי שרירי שלד המותאמים להדמיה וכימות חזקים, קפדניים וניתנים לשחזור של שומן תוך שרירי. צינור הניתוח שלנו מספק מסגרת לאימות התערבויות חדשניות למניעת היווצרות שומן במחלות כמו ניוון שרירים דושן מדגים שההליך יהיה קונור ג'ונסון, טכנאי מחקר מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, לנקות את הרגל כדי להיות מוזרק עם מגבון אלכוהול טרי לחיטוי. משכו 30 עד 50 מיקרוליטרים של 50% גליצרול לתוך מזרק האינסולין. יש להבריש בעדינות את השיער שעל השוק כדי לחשוף את מיקום ה-TA. לאחר איתור ה- TA, הכנס את המחט לתוך TA באופן דיסטלי ליד הקרסול.
מכניסים את המחט במלואה לשריר ומזריקים לאט לאט גליצרול, תוך כדי משיכת המחט בהדרגה המסייעת לפצוע את רוב השריר. יש לרסס באופן חופשי את כל האזורים בעכבר שיש לחתוך לתוכם ב-70% אתנול כדי לסייע בשמירה על שיער מחוץ לאזור הניתוח ולמכשירים. השתמש במספריים כדי לחתוך את העור סביב החלק העליון של הרגל ליד האגן.
משכו בעדינות את עור הרגל מלמעלה למטה ועד הקרסול. ראשית, הסר את שכבת רקמת החיבור החיצונית באמצעות פינצטה חדה לפני קצירת ה- TA. החליקו את הפינצטה מתחת לת"א מתחתית השריר, החל מהגיד הדיסטלי ומשכו בעדינות כלפי מעלה לכיוון הברך. עצור בקצה השריר.
אין לדחוף מעבר להתנגדות שהורגשה בברך התחתונה. אם יש התנגדות משמעותית לפני ההגעה לברך התחתונה, עצרו והמשיכו להסיר שאריות של שכבות של רקמת חיבור. לאחר שהת"א הוסר חלקית מהרגל עם הפינצטה, השתמש באותה תנועה עם אזמל כדי לנתק את החיבור של ה- TA לברך התחתונה.
מעיים את הגיד בקרסול עם מספריים כדי להסיר את ה- TA במלואו. לטפל רק בשריר בגיד כדי למנוע פגיעה בסיבים. חותכים שליש מהת"א בקצה, מול הגיד. שים אותו בצינור המיקרו צנטריפוגה והצמד להקפיא אותו על ידי הטלתו לחנקן נוזלי.
הטביעו את שני השלישים האחרים של הרקמה בבאר מסומנת עם 4% PFA להיסטולוגיה. הקפד לעקוב אחר מתי הרקמה הראשונה והאחרונה הונחה בקיבוע. מניחים על אגוז במשך שעתיים עד שעתיים וחצי בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הקיבוע, הסר PFA מהבארות. יש לשטוף את הרקמות עם PBS אחד קר פעמיים עד שלוש פעמים ולאחר מכן לשטוף פעמיים עד שלוש פעמים עם PBS קר 1X למשך חמש דקות לכל שטיפה. הסר את ה- PBS מהבארות והוסף מספיק 30% סוכרוז ב- 1X PBS כדי לאפשר לרקמה לצוף.
מניחים על המנומר בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הפעל את המיקרוסקופ והפעל את תוכנת ההדמיה. אבטח את השקופית על הבמה.
השתמש בכל ערוץ כדי לזהות את האזור שיש להצטלם. בתוכנת ההדמיה, התאימו את זמן הרווח והחשיפה עבור כל ערוץ. צלם תמונות של כל הרקמה בכל ערוץ ומזג אריחים בודדים כדי ליצור מרוכב של חתך TA המלא.
לפני ההתחלה, מחממים מראש את המים החופשיים של RNase ל-45 מעלות צלזיוס ומכינים 70% אתנול טרי. הוסף 1000 מיקרוליטרים של guanidinium thiocyanate לכל צינור המכיל את הדגימה. חשוב כי נעשה שימוש בצינורות המאושרים על ידי Bead Beater.
הוסיפו שלושה חרוזים בינוניים, או חרוז אחד גדול וחרוז אחד קטן, לכל צינור. הומוגניזציה של הרקמה ב-50 הרץ למשך שתיים עד ארבע דקות באמצעות מכה חרוזים. בהתאם לסוג הרקמה ולגודל המדגם, זה עשוי להימשך עד 10 דקות.
להוסיף 200 מיקרוליטרים של כלורופורם. יש לנער את הדגימות למשך 15 שניות. דגירה למשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12, 000 פעמים G.Pipette החוצה 350 microliters של supernatant שקוף ולהוסיף לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש המכיל 350 microliters של 70% אתנול. היזהרו שלא לשאוף לשכבות החלבון ו/או הדנ"א הנמוכות יותר. העבר עד 700 מיקרוליטרים של תערובת זו לעמוד ספין קטן הממוקם בצינור איסוף של שני מיליליטר.
המשך עם בידוד RNA בהתאם להוראות היצרן. Elute עם 30 עד 50 microliters של מים חופשיים RNase, בהתאם לתפוקה הצפויה. שמור RNA על קרח ומדוד את התשואה באמצעות ספקטרופוטומטר.
שמור את הרנ"א מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש בעד מיקרוגרם אחד של RNA כדי לסנתז cDNA עם ערכת סינתזה של cDNA, בהתאם להוראות היצרן. לאחר השלמת הריצה, הוסף 80 מיקרוליטרים של מים חופשיים RNase.
אחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס. באמצעות פורמט קידוח 384, הוסף מיקרוליטר אחד של פריימר לתחתית כל באר. פריימרים לייבוש חופשי גורמים לשכפולים טכניים הדוקים יותר.
השאירו מכוסים עד שהפריימרים התאדו לחלוטין. הגדר תגובות לדוגמה עם ארבעה עד שמונה שכפולים טכניים. לאחר השלמת ריצת ה-PCR, נרמלו את ערכי סף המחזור הגולמי לרמות הגנים של משק הבית וקבעו שינויים בקיפול על ידי חישוב דלתא-דלתא Ct.פריליפין ואדיפוציטים חיוביים מה-TAs הלא מזוהים שינו באופן משמעותי את המורפולוגיה בהשוואה למקטעים קבועים, מה שהופך את הזיהוי, ההדמיה והכימות שלאחר מכן להרבה יותר קשים ועלולים להיות לא מדויקים.
לעומת זאת, קיבוע PFA משמר את המורפולוגיה האדיפוציטים, ומאפשר זיהוי מדויק של שומן תוך שרירי. בהשוואה לשריר TA לא פגום, פגיעת גליצרול גורמת לביטוי של סמנים אדיפוגניים מוקדמים, כגון גמא PPAR ו- CEBP alpha כבר שלושה ימים לאחר הפציעה. סמנים בוגרים כגון אדיפונקטין ופריליפין ניתן לזהות כבר חמישה ימים לאחר פציעת הגליצרול.
באמצעות מעקב אחר שושלת גנטית, רוב הקולטנים של PDGF אלפא FAPs מבטאים את סמן השושלת EYFP. שבעה ימים לאחר פציעת הגליצרול, FAPs חיוביים של EYFP הפכו לפריליפין חיובי של EYFP המבטא אדיפוציטים, מה שמוכיח כי FAPs הם אכן המקור התאי של שומן תוך שרירי. ניתן גם להתאים את הפרוטוקול כדי לדמיין את התא המיוגני.
באמצעות נוגדנים נגד PAX7 ו- MYOD1, תאי גזע שריריים וסמני מיובלסט, בהתאמה, ניתן לזהות בקלות חמישה ימים לאחר פציעת גליצרול, אפילו בקטעי רקמת שריר קבועים של PFA. פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם כדי לדמיין ולכמת אדיפוציטים ורקמות בוגרות אחרות. בנוסף, טכניקת שימור הרקמות שלנו תואמת את מגוון טכניקות העמידה השונות.
