הדמיה תוך-ורידית מאפשרת לנו לבחון אינטראקציות פיזיולוגיות בתוך המיקרו-סביבה של הגידול. ועל ידי שימוש בשיטה זו, ניתן למדר התנהגויות דינמיות ספציפיות שנצפו באמצעות תכונות רקמה מקומיות. פרוטוקול זה משתמש רק באות נטול תוויות הנמצא בכל מקום מסיבי קולגן או ממטבוליטים אוטופלואורסצנטיים כדי לפלח את ה-TME, ובכך למזער את כמות המניפולציות לעכבר.
שיטה זו ישימה באופן נרחב לכל מערכת תוך-תאית שבה נדרשת הבנת אינטראקציות דינמיות ביחס למבני מטריצה חוץ-תאיים או למבנים וסקולריים. מי שידגימו הליך זה יהיו דייב אינמן, מומחה מחקר בכיר, ואריקה הופמן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה. התחילו להכין זכוכית כיסוי חלון הדמיה של יונקים על ידי השריית זכוכית כיסוי עגולה של 1.5 12 מילימטרים ב-100% אתנול למשך 10 דקות, ואז ייבשו את זכוכית הכיסוי מתחת למנורת חום והצמידו את הזכוכית למסגרת החלון הדמיה של יונק המתכת באמצעות דבק ציאנואקרילט.
לרפא את הדבק למשך הלילה. למחרת, השתמשו במטוש ספוג אצטון כדי לנקות את חלון הדמיית היונקים המורכב מהדבק העודף לפני שתטביעו את חלון הדמיה של היונק ב-70% אתנול למשך 10 דקות לפחות כדי לסייע בניקוי. לאחר הייבוש, אחסנו את חלון הדמיית היונקים המנוקה בצלחת פטרי סטרילית.
לפני תחילת הניתוח להשתלת החלון, כלים כירורגיים של autoclave וחיטוי משטחים עם 70% אתנול. הכינו שולחן מחוטא לניתוח עם שמיכת חימום מכוסה בשדה סטרילי. קבעו את שמיכת החימום כך שהטמפרטורה הנמדדת על גבי השדה הסטרילי היא 40 מעלות צלזיוס.
השתמש בתאורת עזר קרה ובמשקפיים מגדילים לצורך הניתוח. לבשו PPE המורכב ממעיל מעבדה חד-פעמי סטרילי, שרוולים כירורגיים, כפפות, הגנה על העיניים ומסכת פנים. לאחר מכן, להסיר את הפרווה של העכבר המרדים בבלוטת היונק המפשעה הרביעית עם קרם depilatory ולשטוף את האתר הניתוחי עם גזה ספוגה מים סטרילית.
לאחר מכן הכינו את האתר הכירורגי המדולדל לניתוח על ידי חיטוי משטח העור עם שלושה קרצופי בטאדין ואתנול מתחלפים. בסיום, הרימו בעדינות את העור מעל בלוטת החלב מספר ארבע באמצעות מלקחיים. לאחר שהעור נשלף מדופן הגוף, הסר קטע של מילימטר אחד של השכבה העורית בקצה המלקחיים באמצעות מיקרו-חותכים כירורגיים.
מבלי לחתוך את הבלוטה הבסיסית, ליצור חתך 10 מילימטר ולאחר מכן לשחרר את בלוטת החלב מן השכבה העורית עם התנועה העדינה של המלקחיים. הוסיפו PBS כדי לכסות את הבלוטה החשופה. השתמשו בתפר קלוע משי 5-0 כדי ליצור תפר מיתר ארנק לאורך שולי הפתח, ואז הכניסו קצה של חלון הדמיה של החלב כך שהשכבה העורית תתחבר לחריץ המקבל של חלון ההדמיה של החלב.
תוך כדי מתיחת האפיתל בקצה הנגדי של חלון ההדמיה של היונקים, דחפו את חלון ההדמיה של יונק המתכת למקומו כך שהשכבה העורית תפעיל באופן מלא את החריץ המקבל סביב כל היקף חלון הדמיון של היונק. לאחר מכן חרבו את חוט הארנק כדי למשוך את השכבה העורית לתוך החריץ וקשרו את השכבה כדי לאבטח את החלון. יש למרוח אנטיביוטיקה מקומית על השכבה העורית בחלון ההדמיה של היונק ולנטר באופן רציף את העכבר.
לאחר שחזר להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות החזה, אחסן את העכבר המושתל בחלון הדמיה של היונק בנפרד על מצעים רכים עם איגלו שהונח בכלוב ומאפשר לעכבר להתאושש במשך 48 שעות לפני ההדמיה. לצורך ההדמיה, השתמש במערכת אוויר כפויה המוגדרת ל-30 מעלות צלזיוס. השתמשו במחמם מטרה נוסף כדי למנוע סחף במיקוד Z ואפשרו למערכת להגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני ההדמיה.
לאחר מכן הקימו תא חימום על במת המיקרוסקופ. לאחר אישור ההרדמה בשיטת צביטה בבוהן, מוסיפים משחה לעיניים לעכבר. כדי לשמור על הידרציה נכונה, להזריק 0.5 מיליליטרים של PBS תת עורית כל שעתיים למשך ההדמיה.
יש למרוח ג'ל על בסיס מים במקום מים למטרה ולנקות את החלק החיצוני של זכוכית חלון ההדמיה של החלב עם אפליקטור כותנה ומנקה זכוכית לפני העברת העכבר לשלב המיקרוסקופ המחומם מראש. לאחר הנחת העכבר על במת המיקרוסקופ, לחץ על צווארון חלון ההדמיה של היונק לתוך חור קליטה של 14 מילימטרים בתוספת הבמה כדי לייצב את התמונות ולהתאים את צינור האיזופלורן. לאחר מכן הביאו את שדה ההדמיה למוקד באמצעות עיניות המיקרוסקופ והתאורה של ברייטפילד, תוך התבוננות בכלי הדם עם זרימת הדם.
בדוק את יציבות שדה הראייה. אם קיימים ממצאי תנועת נשימה, יש למרוח דחיסה עדינה על החלק האחורי של הבלוטה עם גוש קצף קטן ופיסת סרט דבק דמוית סיכה. לאחר הפעלת הדחיסה, ודא שזרימת הדם נשמרת בכל שדה הראייה.
לאחר שהעכבר מורדם וממוקם בבטחה על שלב המיקרוסקופ ההפוך, התחל לאתר אזורי עניין. באמצעות מקור אור המכוון לחלון ההדמיה של היונקים, השתמשו בעיניים של המיקרוסקופ כדי לזהות אזורים פוטנציאליים לחקירה. ההתמקדות צריכה להיות בראיית כלי הדם וזרימת הדם.
הוסף ושמור את מיקומי XY בתוכנה. כאשר נקבעות רמות ההספק המתאימות, הגדירו את ערימת Z והתבוננו במראה של סיבי קולגן בשפע של 20 עד 50 מיקרומטר מתחת לפני השטח של חלון הדמיית החלב. הקולגן יהפוך לפחות נפוץ ככל שהמיקרוסקופ יעמיק בגידול.
החללים בדור ההרמוני השני או SHG חושפים את מיקומם של מסות הגידול. הגדר את פרוסת Z העליונה מתחת לשכבת התאים הבודדים כאשר סיבי הקולגן הראשונים מופיעים על 50 עד 100 מיקרון. הגדר את פרוסת Z התחתונה על 250 מיקרומטרים שבהם הסיבים דוהים החוצה והאות הלקוי שולט.
לאחר מכן חזור על ההליך עבור כל עמדות XY שנשמרו. לאחר הגדרת טווח מחסנית Z, הגדל את זמן השהייה לשמונה מיקרו-שניות ובצע אופטימיזציה של הגדרות ההספק והגלאי. מטב את רמות ההספק הדרושות כדי להלהיב את הרקמה עבור כל ניסוי והשתמש בהספקים של עד 90 מילי-וואט ב-750 ננומטר או 70 מילי-וואט ב-890 ננומטר בפתח האחורי של המטרה.
לאחר מכן, התחילו במרווחים של 10 דקות בין נקודות איסוף עבור רוב סרטי ההעברה התוך-לוויטליים והתאימו את מרווחי הזמן בהתאם למטרות הניסוי. אם נצפים סימנים של פוטוטוקסיות כמו הלבנת תאים או הגדלה מהירה של האוטו-פלואורסצנציה והלבנת פוטו-אקונומיקה מוגזמת, הפחיתו את עוצמת הלייזר או הגדילו את מרווחי הזמן כפי שעולה מהתנאים. עבור הדמיית אורך חיים פלואורסצנטי או FLIM של NADPH, התחל בסריקת תצוגה מקדימה והתאם את עוצמת הלייזר עד שהקריאה של מפלה השברים הקבוע או CFD תהיה בין 10 לחמישית ו-10 לשישית.
חריגה מ-CFD מעבר ל-10 לתוצאה השישית בערימת פוטונים ותוצאות כלליות גרועות. לאחר הגדרת רמת ההספק, הגדר את זמן האינטגרציה בין 90 ל- 120 שניות והתחל את אוסף FLIM כדי להשיג פוטונים משדה הראייה למשך הזמן המוקצב. שדה ראייה טיפוסי בתוך גידול החלב ללא תווית הדגים שפע של סיבי קולגן ליד החלון וירידה בשפע עמוק יותר לתוך הגידול.
השימוש בחיים פלואורסצנטיים או NADPH סייע בזיהוי כלי הדם. חלק מהאזורים הכהים בתמונות היו קפלי גידולים או התבקעות של אונות גידול סמוכות. כדי לזהות כלי דם, תמונה מורכבת באמצעות NDPH FLIM אומתה על ידי השוואת הקרנות בעוצמה המרבית של הערימה התוך-ורידית לפני ואחרי הזרקת וריד הזנב של דקסטרן פלואורסצנטי.
הניתוח הייצוגי מראה את הכימות של ארבעה עכברים ואת שדות הראייה. כדי לשרטט את הגבולות של מסות הגידול נטולות התוויות, נעשה שימוש באוטופלואורסצנציה של NADPH. התמונות דיווחו על החתימות המטבוליות של התאים ועל מיקומם של כלי הדם.
גם ה-AFD זיהה את המקרופאגים. עם ערכת הסגמנטציה, הגידול נטול התוויות חולק לתאים עבור קן הגידול, סטרומה וכלי דם באמצעות SHG ו- NADPH אוטופלואורסצנציה בלבד. בנוסף, ניתן לסווג את סיבי הסטרומה והקולגן גם לאזורים מקומיים של הסיבים המיושרים.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור עבור פרוטוקול זה הוא לוודא כי העכבר מסומם כראוי ומרוסן, כך שדה הראייה נשאר יציב להדמיה.
