פרוטוקול זה משלב ניתוח תמונה מונחה בינה מלאכותית לצורך סגמנטציה של רקמות. עם היסטולוגיה קציר סלקטיבי על ידי מיקרודיסקציה בלייזר ומקרב אותנו למציאות של פתומיקה. הגדרה מראש של החזר ההשקעה על רקמות באמצעות בינה מלאכותית, מגבילה את זמן השהייה של החלקות הרקמה בטמפרטורת הסביבה, מפחיתה את המאמץ של כוח האדם לביצוע יבולים אלה ומפחיתה את השתנות המפעילים.
טכניקה זו ישימה באופן נרחב לכל מחקר מבוסס מחלה או פתולוגיה הכולל איסוף או העשרה של אוכלוסיות תאיות ספציפיות מדגימות רקמות. שיטה זו פשוטה למשתמשים עם ידע בסיסי בהיסטופתולוגיה וניסיון ב- LMD. המפתח הוא לוודא שאתה חותך כיול נקי עבור התאים ולאמן את המסווג היטב.
כדי להתחיל, ודא כי השקופית יבשה לחלוטין לפני חיתוך fiducials כיול הייחוס. פתח את תוכנת Microdissection לייזר ופתח את קובץ מזחלת נקודות הכיול המוגדר כברירת מחדל תחת האפשרות ייבוא צורות. טען את המגלשה כאשר הרקמה פונה כלפי מטה וצד התווית קרוב יותר למפעיל.
לתוך מחזיק השקופיות בשלב המיקרו-דיסקציה של הלייזר, בחר את המיקוד האוטומטי לפני אפשרות החיתוך. באמצעות מיקרוסקופ הלייזר וקובץ מזחלת נקודות הכיול המוגדר כברירת מחדל, חותכים את הפידוקיאלים של הכיול לממברנת PEN. עבור אוספים מועשרים במיקרו-דיסקציה בלייזר בלבד, פתחו את תוכנת ניתוח התמונות.
בחר תמונות פתוחות, ומהחלון הקופץ בחר את קובץ התמונה dot svs שנוצר מסריקת השקופית. נווט אל הכרטיסיה ביאורים, בחר והשתמש בכלי הביאור המלבני כדי לצייר תיבה סביב הרקמה. בחר את ביאור התיבה ולחץ לחיצה ימנית על התמונה.
בחר/י בתפריט הנפתח המתקדם ולאחר מכן לחץ/י על אפשרות המחיצות. הגדר את גודל האריחים ואת הרווח בין 500 ל- 40 בהתאמה, ובחר אישור ליצירת האריחים. בחר ומחק את ביאור התיבה ההיקפית המשמש ליצירת האריחים.
בחר/י בתפריט הנפתח של פעולות השכבה ולאחר מכן לחץ/י על ״ייצוא״ כדי לשמור את הביאורים המרוצפים כקובץ ביאור נקודה. מקם עותק שמור של אלגוריתם Python dapa, שפותח כדי למזג את שכבות הביאור המסווגות של AI לאותה תיקייה כמו קובץ הביאורים המרוצפת. העתק את שם קובץ הביאור המרוצפת.
פתח את תוכנית Python באמצעות סביבת הפיתוח המשולבת הלא פעילה והדבק את שם קובץ ההערה המרוצפת בין המרכאות בתחתית התוכנית. בחר/י בתפריט הנפתח ״הפעל״ ולאחר מכן לחץ/י על ״הפעל״. המתן עד שייווצרו כמה קבצים שימזגו את כל הביאורים המרוצפים באריחים בשכבה אחת.
פתח את תוכנת ניתוח התמונות ונווט לכרטיסייה ביאורים. בחר/י בתפריט הנפתח של פעולות השכבה ולאחר מכן לחץ/י על מחק/י את כל השכבות כדי להסיר את כל הביאורים מהתמונה. בחר/י בתפריט הנפתח ״פעולות שכבה״ ולאחר מכן לחץ/י על ״יבא קובץ ביאור מקומי״.
בחלון המוקפץ, בחר את קובץ ביאור הנקודות הממוזג שנוצר על-ידי קובץ ה- Script. ודא שכל האריחים המיובאים נמצאים תחת אותה שכבת ביאור. מכרטיסיית המסווג, בצע את הוראות היצרן כדי להדגיש אזורים מייצגים של הגידול, סטרומה ורקע שקופיות זכוכית ריקה ROIs.
לפני הפעלת המסווג, לחץ על אפשרויות מסווג מתקדמות, בחר את שכבת הביאור הרצויה על-ידי סימון התיבה ROI או תיבות בכרטיסיה ביאורים. השתמש באפשרות שכבת ההערה מתפריט הפעולות המסווגות כדי להפעיל את המסווג. לאחר השלמת ניתוח המסווג, נווט לכרטיסיה ביאורים ובחר את שכבת הביאור שנוצרה מהניתוח.
בחר/י בתפריט הנפתח ״פעולות שכבה״ ולאחר מכן לחץ/י על ״מחק/י את כל השכבות אך הנוכחיות״ כדי להסיר את כל שכבות הביאור האחרות מהתמונה. לאחר מכן, בחר בתפריט הנפתח של פעולות השכבה ולאחר מכן לחץ על ייצוא כדי לשמור את הביאורים כקובץ ביאור נקודה. צור תיקיה עבור ההפעלה או הפרוייקט ושמור את קובץ ביאור הנקודות בתוך תיקיית משנה.
מסומן עם המזהה הייחודי של השקופית. נווט אל הכרטיסיה ביאורים, בחר את התפריט הנפתח של פעולות השכבה ולאחר מכן לחץ על מחק את כל השכבות כדי להסיר את כל הביאורים מהתמונה. בחר את כלי העט וצייר קו קצר מכל פידוקיאל כיול.
צייר קווים מהסימנים בסדר הבא. למעלה משמאל, למעלה מימין, מימין למטה. בחר/י בתפריט הנפתח של פעולות השכבה ולאחר מכן לחץ/י על ״ייצוא״ כדי לשמור את הביאורים המרוצפים כקובץ של ביצוע ביאור.
הוסף את המעטפת התחתונה לשם הקובץ ומקם את הקובץ בתיקיית המשנה המכילה את הקואורדינטות עבור הצורות המרוצפות באריחים. העתק את הכתובת עבור הפרויקט הראשי. פתח את ה- Script יוצר ייבוא XML באמצעות סביבת הפיתוח המשולבת הלא פעילה ולאחר מכן הדבק את כתובת תיקיית הפרוייקט בין המרכאות בתחתית קובץ ה- Script.
בחר בתפריט הנפתח הפעל ולאחר מכן לחץ על מודול הפעלה כדי להפעיל את קובץ ה- Script. טען את שקופית הממברנה המסומנת כאשר הרקמה פונה כלפי מטה וצד התווית קרוב יותר למפעיל למחזיק המגלשה בשלב מיקרוסקופ הלייזר. בחר ייבוא צורות מהתפריט הנפתח של הקובץ.
בחר את קובץ הייבוא של הנקודה XML, LMD שנוצר עבור השקופית. בחר לא בחלון הקופץ כדי להימנע מטעינת נקודות ייחוס מהקובץ, ולא בחלון הקופץ השני כדי להימנע משימוש בנקודות ייחוס שאוחסנו בעבר לצורך כיול. עקוב אחר ההנחיות מיישום המיקרו-דיסקציה של לייזר ויישר את צלב הכיול לכל אחד משלושת הפידוקיאלים של הכיול בשקופית.
חפש את הפידוקיאלים של הכיול המופיעים בפינה השמאלית העליונה, הימנית העליונה והימין התחתון של תמונת השקופית. בתוכנת ניתוח התמונה שתתאים לנקודות ייחוס של שקופית המיקרו-דיסקציה ההפוכה בלייזר על במת המיקרוסקופ. עברו בין שימוש בעדשה הסובייקטיבית 5x לאיתור, לבין העדשה הסובייקטיבית 63x כדי ליישר כל פידוקציה של כיול.
בחר לא בחלון הקופץ כדי להימנע משמירה על נקודות ההפניה בקובץ, ובאשר בחלון הקופץ השני כדי לאשר שהשקופית נוספה. הזז את העדשה הסובייקטיבית 5x למקומה ובחר כן בחלון הקופץ כדי להשתמש בהגדלה בפועל. לאחר הופעת הצורות המיובאות, מקד את המצלמה ברקמה.
סמן ובחר את כל הצורות בחלון רשימת הצורות. גררו אותם למקומם באמצעות ביאור אחד או שניים בתוך שדה הראייה כהפניות ויישרו את ציר ה-z האנכי לחיתוך עם הלייזר. טען את הצינורות למחזיק צינור אוניברסלי המיועד למיקרו-צינוריות PCT.
סקור את הצורות המיובאות והקצה אותן למיקום הצינור המתאים לאיסוף. לחץ על התחל לחתוך כדי להפעיל את הלייזר. לפרוק ולסגור את צינור הדגימה עם רקמות LMD ולשים על קרח יבש.
לאחר תרמו-מחזור וצנטריפוגה, ה-LMD קטף דגימות רקמה, מסיר ומשליך את המיקרו-קאפסים מהמיקרו-צינוריות של PCT. מוסיפים טריפסין, מוסיפים יחס של מיקרוגרם אחד לכל רקמה בריבוע של 30 מילימטרים. ולהכניס מיקרו-מזיקים לתוך הצינור המיקרו באמצעות כלי המיקרו-קאפ.
העבר את המיקרו-צינוריות למחסנית מחזור חבית והרכב את המחסנית השלמה. מכניסים את המחסנית לתא הלחץ של מחזור הקנה ומאבטחים את המכסה. מחזור חבית ב 45, 000 PSI במשך 50 שניות ולחץ אטמוספרי במשך 10 שניות ב 50 מעלות צלזיוס במשך 60 מחזורים.
לניתוח LC-MS MS, טען בקבוקוני סמפלר אוטומטיים במיקומים המתאימים לדוגם האוטומטי של הכרומטוגרפיה הנוזלית. סגור את הסולם האוטומטי ונתח שברים בודדים בשיטת ספקטרומטריית שיפוע ומסה מתאימה. אשכולות היררכיים ללא פיקוח באמצעות 100 החלבונים המשתנים ביותר.
הביאה להפרדת סרטן השחלות הסרוסיות בדרגה גבוהה וסוגי קרצינומה של תאים צלולים בשחלות ממיקרודיסקציה בלייזר מועשרים ודגימות גידול שלמות. לעומת זאת, המיקרו-דיסקציה של הלייזר העשירה דגימות סטרומה הן מסרטן שחלות סרוס בדרגה גבוהה והן מקרצינומה של תאים צלולים בשחלות. מקובצים יחד ובאופן עצמאי ממיקרו-דיסקציה של לייזר מועשרים בגידול ובדגימות גידול שלמות.
מתוך 5, 971 חלבונים מכמתים, 215 שונו באופן משמעותי בין אוספי גידולים שלמים מסרטן שחלות סרוס בדרגה גבוהה לבין דגימות קרצינומה של תאים צלולים בשחלות. מתוך 76 חלבוני החתימה שכומתו על ידי יוז בכלל, 57 כומתו יחד במערך נתונים זה והיו מתואמים מאוד אימון המסווג הוא החלק המאתגר ביותר. בעקבות הוראות התוכנה של מעבדת אינדיקה ושכלול המסווג שחזרו את התוצאות המדויקות ביותר.
כל השאר הוא סטנדרטי. הרקמה שנקטפה באמצעות זרימת עבודה זו של LMD המונעת על ידי בינה מלאכותית תואמת למגוון יישומים אנליטיים במורד הזרם, כולל פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה המתוארת כאן או ניתוחים גנומיים, תעתיקים או אנליזות אומיות אחרות.
