מכיוון שהריאה מארחת מערכת חיסונית מורכבת וייחודית מאוד, פותחו ודווחו מספר אסטרטגיות gating לזיהוי תאי מערכת החיסון של הריאות. קיומן של מספר גישות שונות מקשה על השוואת תוצאות שנוצרו על ידי מעבדות שונות. אסטרטגיית הגיטינג שלנו מספקת דרך מקיפה וניתנת לשחזור לזהות עד 12 אוכלוסיות מיאלואידיות ריאתיות שונות ואוכלוסיות חיסוניות שאינן מיאלואידיות באמצעות תשעה סמנים.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר אפיון וזיהוי של אוכלוסיות חיסוניות ריאות בתנאים יציבים. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות שינויים של אוכלוסיות תאים אלה במודלים שונים של מחלות, שם זה יכול לעזור לזהות שינויים ספציפיים למחלה של הנוף החיסוני של הריאות. חוקרים המבצעים טכניקה זו בפעם הראשונה צריך לשים לב לתנאי העיכול ריאגנטים, כפי שהם עושים הבדל גדול בשחרור של תאי החיסון מרקמת הריאה.
התחל על ידי הכנת החיה המתת חסד לניתוח. לייצב את העכבר הגב באמצעות מחטים או סרט על ארבע הגפיים, ולאחר מכן להשתמש 70% אתנול כדי לחטא את העור של אזור הגחון. לעשות חתך מהצוואר לבטן.
הסר את העור מאזור בית החזה, יחד עם הצלעות ועצם החזה. לשטוף את הריאות על ידי הזרקת 10 מיליליטר של PBS קר לחדר הימני באמצעות מחט 18 עד 21 מד עד שהם הופכים לבנים לחלוטין. לאחר מכן, להסיר את התימוס והלב מבלי לגעת בריאות.
לנתק את הריאות מן הרקמות שמסביב ולהעביר אותם לתוך צינור המכיל חיץ BSA קר. מעבירים את הריאה לצלחת פטרי, טחנים אותה באמצעות שני אזמלים עדינים, ולאחר מכן מניחים אותה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. הוסף חמישה מיליליטר של חוצץ עיכול לשטוף את הצלחת.
מאבטחים את מכסה הצינור ומעכלים את הריאה במשך 30 דקות על שייקר מסלולית במהירות של 150 סיבובים לדקה ב 37 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מיליליטר של מאגר BSA קר. לאחר העיכול, מערבבים וממיסים את חתיכות הריאה באמצעות מחט 18-מד.
מניחים מסננת מסננת של 70 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר ומעבירים את תערובת הריאות המעוכלת למסננת. השתמש בצד הגומי של בוכנה מזרק 10 מיליליטר כדי לרסק את חתיכות הריאה הנותרות על המסנן ולשטוף אותו עם חיץ BSA. צנטריפוגה השעיה תא יחיד ב 350 G במשך שמונה דקות בשבע מעלות צלזיוס.
השלך את supernatant ו resuspened התאים במיליליטר אחד של מאגר תמוגה ACK. מערבבים את ההשעיה באמצעות פיפטה של מיליליטר ודוללים אותה במשך 90 שניות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 10 מיליליטר של חיץ BSA קר לתערובת התגובה וצנטריפוגה זה ב 350 גרם במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.
להשליך את supernatant, resuspend את הכדור במאגר כתמים, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer. לפנק מחדש את התאים בריכוז של 5 מיליון תאים למיליליטר לכתמת פני השטח. העבר 1 מיליון תאים ב 200 מיקרוליטרים לבאר לתוך צלחת 96 באר וצנטריפוגה הצלחת ב 350 G במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הכן פתרון בלוק cytometry זרימה על ידי דילול נוגדן נגד 1632 חוצץ כתמים. הגדילו מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטרים של תמיסת בלוק ציטומטריית הזרימה. לדגור על ההשעיה במשך 15 עד 20 דקות בארבע מעלות עבור צלזיוס או על קרח.
לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של חיץ כתמים לצלחת צנטריפוגה זה 350 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הכן פתרון נוגדנים משטח על ידי דילול הנוגדנים על פני השטח במאגר כתמים. לשפץ את התאים ב 50 מיקרוליטרים של פתרון נוגדן פני השטח ולדגור את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס בחושך.
לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ כתמים. הכן את חיץ הקיבעון והחדירות על ידי ערבוב של שלושה קיבוע חלקים ודילול חדירות וחלק אחד של מאגר כתמים. הקדישו מחדש את התאים ל-50 מיקרוליטרים של המאגר המוכן מראש לבאר של הצלחת בת 96 הבאר ודגרו אותם במשך 20 עד 25 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.
לדלל את חיץ permeabilization עם מים מטוהרים deionified להכין פעם אחת חוצץ permeabilization ולהשתמש בו כדי לשטוף את התאים. הכן פתרון נוגדנים תאיים על ידי דילול עם מיליליטר אחד של מאגר פרמביליזציה. לשפץ את התאים ב 50 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים תאיים מדוללת לבאר של צלחת 96 באר ודגר במשך 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.
לשטוף את התאים עם מאגר חדירות, ולאחר מכן עם מאגר כתמים. לאחר השטיפה הסופית, הקדישו מחדש את התאים ל-200 מיקרוליטרים של חיץ כתמים. לרכוש מינימום של 1.5 מיליון תאים לכל מדגם על cytometer הזרימה.
לאחר ניתוח מוצלח והליך מתאים לאחר הניתוח, הפסולת והכפילים הוחרגו באמצעות אסטרטגיית gating. תאי מערכת החיסון זוהו באמצעות סמן CD45 + hematopoietic באמצעות cytometry זרימה. התאים נבדלו כחיים או מתים.
תאי הריאה החיסוניים סווגו לשלוש קבוצות באמצעות נוגדנים נגד GR-1 ואנטי CD68. נויטרופילים זוהו ואומתו באמצעות Ly6G כסמן ייחודי. אוכלוסיית CD45+מכילה גם תאי רוצח טבעיים, תאי T ותאי B.
תאים אלה היו מוכתמים ואומתו על ידי רוצח טבעי 1.1, CD3, ו B220 נוגדנים. שטיפת הסימפונות זיהתה אאוזינופילים שהיו חיוביים לסמן CD11b, ומקרופאגים מכתשיים שלא הביעו רמות גבוהות של CD11b. CD45 + תאים דנדריטיים נמצאו ואושרו על ידי ביטוי CD24.
תאים אלה הראו תגובה חיובית או שלילית כלפי סמני CD103 ו- CD11b. תאים שליליים CD103 סווגו כתאים דנדריטיים קונבנציונליים ומונוציטים המבוססים על ביטוי CD64. התאים הדנדריטיים שמקורם במונוציטים היו חיוביים נמוכים עבור הסמן הדנדריטי CD24, וחיוביים לסמן פאן-מקרופאג' CD64.
מקרופאגים ביניים עם מונוציטים קלאסיים ולא קלאסיים נבדלו בהתבסס על ביטוי CD64 ו- GR-1. תאים אלה הראו ביטוי חיובי עבור קולטן כימוקין CX3C אחד. השלבים החשובים ביותר בהליך זה הם קצירת רקמות נכונה, עיכול, והכנה של השעיה של תא יחיד, ו gating על תאים חיים סינגלים.
בנוסף לאפיון תאי החיסון של הריאה על ידי ציטומטריית זרימה, תרבית התאים והבדיקות התפקודיות יכולות להתבצע באוכלוסיות תאים מבודדות. טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים לחקור שאלות חדשות במחלות של הריאה, כגון זיהומים, מחלות אוטואימוניות וסרטן.
