הפרוטוקול מספק מודל לחקירת מנגנונים של פגיעה בכלי הדם והתפתחות בצקת לאחר מכן באופן לא פולשני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול לעקוב אחר הפציעה לחיות לאורך זמן ללא התערבות כירורגית. זה מספק דרכים לבדוק טיפולים בצורה יעילה יותר.
זה יכול להיות מאתגר ללמוד כיצד לבצע ורידים נכונים בזנב ולהכיל את בעל החיים בפלטפורמה בצורה נכונה. בשתי הטכניקות אני ממליץ להיות סבלני ולקחת את הדברים לאט. כדי להתחיל, טפל בעדינות בכבל הסיב האופטי וחבר אותו לקופסת בקרת הלייזר ולמתאם הלייזר של מיקרוסקופ הדמיה ברשתית, ולאחר מכן הפעל את תיבת המנורה של מיקרוסקופ הדמיה ברשתית.
הפעל את המחשב ופתח את תוכנית ההדמיה. הניחו פיסת נייר לבן מול עינית המיקרוסקופ וכווננו את האיזון הלבן על ידי לחיצה על התאימו בתוכנית ההדמיה. הפעל את תיבת בקרת הלייזר על-ידי סיבוב המקש וביצוע ההוראות שעל המסך של תיבת בקרת הלייזר.
כדי לאמת את עוצמת הלייזר הבסיסית, הגדר את תיבת בקרת הלייזר ל- 50 מילי-וואט ו- 2, 000 אלפיות השנייה. לאחר מכן הפעל את הלייזר והנח את מד החשמל מול העינית. לחץ על דוושת מתג הרגל כדי להפעיל את הלייזר, במטרה שקריאת עוצמת הלייזר תהיה 13 עד 15 מילי וואט.
לאחר מכן, באמצעות מסך תיבת הבקרה של הלייזר, התאם את עוצמת הלייזר הניסיונית ל- 100 מילי-וואט ו- 1, 000 אלפיות השנייה, וכבה את הלייזר. יוצקים 300 מיליליטר מים לכוס של 500 מיליליטר ומחממים את הכד במיקרוגל למשך דקה. לאחר מכן מניחים גזה במים החמים.
לאחר מכן הכניסו עכבר זכר בן חודשיים לרסן. לחץ את הגזה החמה לתוך זנב העכבר בעדינות ולחפש את הוורידים המורחבים. באמצעות מחט של 26 מד, יש להזריק את הכמות המתאימה של ורד בנגל בהתאם למשקל בעל החיים ולהפעיל לחץ על אתר ההזרקה כדי למנוע המטומה או דימום לפני ניגוב האתר.
לאחר מכן שחררו את העכבר מהרסן והחזירו אותו לכלוב. המתן שמונה דקות לבנגל הוורד להסתובב לפני הזרקת חומרי הרדמה. הפעל את פלטפורמת העכבר המחוממת.
לאחר מכן להוסיף טיפה אחת של phenylephrine ו tropicamide בכל עין של העכבר. לאחר אישור ההרדמה, להוסיף טיפה אחת של proparacaine hydrochloride לכל עין, ולאחר מכן להוסיף משחת עיניים לשתי העיניים. לאחר מכן, להזריק 150 מיקרוליטר של carprofen תת עורית בין האוזניים.
לאחר מכן התאימו את העכבר על הפלטפורמה וכווננו את הפלטפורמה עד שהתצוגה של פונדוס הרשתית ברורה וממוקדת. ספרו את ורידי הרשתית וצלמו את הפונדוס. לאחר מכן, הפעל את הלייזר וכוון לכיוון וריד הרשתית במרחק של כ -375 מיקרומטר מהדיסק האופטי.
להקרין את הכלי על ידי לחיצה על מתג כף הרגל ולהזיז מעט את קרן הלייזר עד 100 מיקרומטר. חזור על שלב זה שלוש פעמים והזז את קרן הלייזר לאחר כל פעימה, כך שהקרינה לא תתמקד בנקודה אחת. חזור על ההקרנה על כלי שיט גדולים אחרים כדי להשיג שניים עד שלושה חסימות.
לאחר הקרנת הכלים, לכבות את המנורה ולחכות 10 דקות. לאחר מכן הפעל את המנורה שוב, ספור את מספר הוורידים הסתומים, וצלם תמונה של הפונדוס. לאחר רכישת התמונה והזרקת מי מלח, יש להוסיף טיפות עיניים סיכה ומשחת ג'ל לשתי העיניים.
צפו בעכבר כשהוא מתאושש מהרדמה והחזירו אותו לכלוב עם בעלי חיים אחרים רק כאשר הוא מחלים לחלוטין. מספר החסימות שהושגו מיד לאחר הקרנת לייזר לא היה שונה בין בעלי חיים שעברו לייזר 10 ו-20 דקות לאחר מתן ורדים. מספר החסימות שנמשכו עד יום אחד לאחר חסימת ורידים ברשתית ירד באופן משמעותי בבעלי חיים שעברו לייזר 20 דקות לאחר מתן ורדים, ללא תלות בגנוטיפ.
מבלי לשנות את הספק הניסוי של 100 מילי-וואט, הספק לייזר בסיסי נמוך של 11.5 מילי-וואט לא הביא לחסימות. לעומת זאת, תפוקת לייזר בסיסית של 13.5 מילי-וואט הביאה לחסימות מוצלחות. ארבעה סוגים עיקריים של חסימות מתרחשים לאחר פוטוקואגולציה בלייזר: כלי דם מוסתרים לחלוטין, כלי דם מוסתרים חלקית, כלי רפרועם חלקית, וכלי נפרץ באופן מלא.
כלי הדם המוקרנים של עכברי הנוקאאוט Casp9 של תאי אנדותל המושרים בטמוקסיפן בילו זמן רב יותר במצבים של פרפרציה חלקית והסתרה חלקית מאשר זה של עכברי C57 Black 6, שבילו זמן רב יותר במצבים חסומים לחלוטין. מצב החסימה של כלי הדם משתנה במהירות בתוך 10 הדקות הראשונות לאחר פוטוקואגולציה לייזר ודימומים בצורת להבה נצפים 24 שעות לאחר הפציעה. פתולוגיות אופתלמיות שונות התרחשו לאחר חסימת ורידים ברשתית.
ניתן לכמת את רמת הבצקת ברשתית לאחר חסימת ורידים ברשתית בעיניים הפגועות באמצעות תמונות טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית. מצב השכבות העצביות יכול להיקבע גם על ידי הערכת חוסר הארגון של שכבות פנימיות ברשתית. דוגמה לתמונת טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית עם התוויות המתאימות לכל שכבה מוצגת כאן.
מדידת עוצמת הלייזר הבסיסית חשובה. קריאה זו תשפיע מאוד על הצלחת החסימות וניתן לייעל אותה. ניתן לבצע שיטות נוספות כגון OCT, ERG ואופטיגר.
זה יעזור לטפל בהשפעות של פגיעה נוירו-וסקולרית על שלמות עצבית הרשתית ותפקוד מסלול הראייה. טכניקה זו סוללת את הדרך לחקור את המסלולים המולקולריים המניעים מחלות נוירו-וסקולריות, ועל ידי מעקב אחר בעלי חיים בודדים לאורך זמן, מספקת נתונים אשר יכולים להיות מתורגמים בקלות רבה יותר למחלות אנושיות.
