Протокол предоставляет модель для исследования механизмов повреждения сосудов и последующего развития отеков неинвазивным способом. Основным преимуществом данной методики является то, что можно следить за травмой в течение долгого времени без хирургического вмешательства. Это дает возможность более эффективно тестировать методы лечения.
Может быть сложно научиться выполнять правильную венозу хвоста и правильно размещать животное на платформе. Для обеих техник я рекомендую быть терпеливым и принимать вещи медленно. Для начала аккуратно обработайте оптоволоконный кабель и подключите его к лазерному блоку управления и лазерному адаптеру микроскопа визуализации сетчатки, затем включите ламповый блок микроскопа для визуализации сетчатки.
Включите компьютер и откройте программу создания образов. Поместите лист белой бумаги перед окуляром микроскопа и отрегулируйте баланс белого, нажав кнопку «Настроить» в программе визуализации. Включите лазерный блок управления, повернув ключ и следуя инструкциям на экране лазерного блока управления.
Чтобы проверить базовую мощность лазера, установите блок управления лазером на 50 милливатт и 2 000 миллисекунд. Затем включите лазер и поместите измеритель мощности перед окуляром. Нажмите педаль ножного переключателя, чтобы активировать лазер, стремясь к тому, чтобы показания мощности лазера составляли от 13 до 15 милливатт.
Затем, используя экран лазерного блока управления, отрегулируйте мощность экспериментального лазера до 100 милливатт и 1000 миллисекунд и выключите лазер. Налейте 300 миллилитров воды в 500-миллилитровый стакан и согрейте стакан в микроволновой печи в течение одной минуты. Затем поместите марлю в теплую воду.
Далее поместите двухмесячного самца мыши в ограничитель. Осторожно вдавите теплую марлю в хвост мыши и найдите расширенные вены. Используя иглу 26-го калибра, введите соответствующее количество розовой бенгальской в соответствии с весом животного и надавите на место инъекции, чтобы предотвратить гематому или кровотечение, прежде чем протирать участок.
Затем отпустите мышь от ограничителя и верните ее в клетку. Дайте восемь минут, чтобы роза бенгальская циркулировала перед инъекцией анестетиков. Включите нагретую платформу мыши.
Затем добавьте по одной капле фенилэфрина и тропикамида в каждый глаз мыши. После подтверждения анестезии добавьте по одной капле гидрохлорида пропаракаина на глаз, затем добавьте глазную мазь на оба глаза. Далее вводят 150 микролитров карпрофена подкожно между ушами.
Затем разместите мышь на платформе и отрегулируйте платформу до тех пор, пока вид глазного дна сетчатки не станет четким и сфокусированным. Подсчитайте вены сетчатки и сделайте снимок глазного дна. Затем включите лазер и направьтесь в вену сетчатки примерно в 375 микрометрах от диска зрительного нерва.
Облучают сосуд нажатием на ножной переключатель и слегка перемещая лазерный луч до 100 микрометров. Повторите этот шаг три раза и перемещайте лазерный луч после каждого импульса, чтобы облучение не было сфокусировано в одном месте. Повторите облучение на другие крупные сосуды, чтобы достичь двух-трех окклюзий.
После облучения сосудов выключите лампу и подождите 10 минут. Затем снова включите лампу, подсчитайте количество закупоренных вен и сделайте снимок глазного дна. После получения изображения и введения физиологического раствора добавьте смазочные глазные капли и гелевую мазь на оба глаза.
Наблюдайте за мышью, как она восстанавливается после анестезии, и возвращайте ее в клетку с другими животными только тогда, когда она полностью выздоровеет. Количество окклюзий, достигнутых сразу после лазерного облучения, не отличалось между животными, которых лазером подвергали через 10 и 20 минут после введения розовой бенгалии. Количество окклюзий, выдержанных до одного дня после окклюзии вен сетчатки, значительно уменьшилось у животных, получавших лазер через 20 минут после введения розовой бенгалии независимо от генотипа.
Без изменения экспериментальной мощности в 100 милливатт низкая базовая мощность лазера в 11,5 милливатт не привела к окклюзии. Напротив, базовый лазерный выход 13,5 милливатт привел к успешной окклюзии. Четыре основных типа окклюзий происходят после лазерной фотокоагуляции: полностью закупоренные сосуды, частично закупоренные сосуды, частично реперфузированные и полностью реперфузированные сосуды.
Облученные сосудистая система тамоксифен-индуцируемых эндотелиальных клеток нокаутных мышей Casp9 провела больше времени в частично реперфузированных и частично закрытых состояниях, чем у мышей C57 Black 6, которые проводили больше времени в полностью закрытых состояниях. Состояние окклюзии сосудов быстро меняется в течение первых 10 минут после лазерной фотокоагуляции, а пламенные кровоизлияния наблюдаются через 24 часа после травмы. Различные офтальмологические патологии возникали после окклюзии вен сетчатки.
Уровень отека сетчатки после окклюзии вен сетчатки может быть количественно определен в поврежденных глазах с помощью изображений оптической когерентной томографии. Состояние нейронных слоев также можно определить, оценив дезорганизацию внутренних слоев сетчатки. Здесь показан пример изображения оптической когерентной томографии с соответствующими метками для каждого слоя.
Измерение базовой мощности лазера имеет важное значение. Это считывание сильно повлияет на успех окклюзий и может быть оптимизировано. Могут быть выполнены дополнительные методы, такие как OCT, ERG и Optiger.
Это поможет устранить влияние нейрососудистого повреждения на целостность нейронов сетчатки и функцию зрительного пути. Этот метод прокладывает путь к опросу молекулярных путей, приводящих к нейрососудистым заболеваниям, и, наблюдая за отдельными животными с течением времени, предоставляет данные, которые могут быть более легко переведены в болезнь человека.
