אנו מספקים בדיקה של מולקולה בודדת כדי לבחון את הפרדת הפאזה של גורמי שעתוק על DNA טכניקה זו מאפשרת מימוש בזמן אמת של התהליך הדינמי של גורמי שעתוק המורכבים כטיפה נוזלית על הדנ"א. EWS-FL1 הוא אחד מגני האיחוי המעורבים ביותר בגידולי סרקומה ע"ש יואינג. המחקר שלנו יכול לזהות את הקשר בין מספר מוטיב הדנ"א לבין היווצרות עיבוי EWS-FL1 הקשור לתעתוק גנים עקרים בתאי הגידול, ואולי מועיל לפרוגנוזה.
ניתן ליישם שיטה זו כדי לחקור כל עיבוי שעתוק או קומפלקסים במבחנה, כמו P53 ו- MED1. כדי להכין תא זרימה עם מחסומים מפוברקים של ננו-זיגזג לניסוי וילון DNA, חברו את צינורות הקלט והפלט בכיוון הנכון. לאחר מכן לשטוף את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של מאגר שומנים באמצעות שני מזרקים שלושה מיליליטר, להבטיח שאין בועה בתא הזרימה.
מוציאים את המזרק מהפלט ומזריקים מיליליטר אחד מתמיסת הליפוזום שלוש פעמים עם דגירה של חמש דקות בין כל הזרקה. לריפוי, שטפו מחדש את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של חיץ שומנים באיטיות, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. במהלך הדגירה, הכינו את חיץ BSA כפי שצוין בכתב היד של הטקסט.
לאחר מכן לאחר 30 דקות של ריפוי, לשטוף את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של חיץ BSA מצד הפלט. לאחר מכן, להזריק 800 microliters של חיץ streptavidin לתוך תא הזרימה מצד הקלט בשני שלבים עם דגירה של 10 דקות לאחר כל צעד. לאחר מכן לשטוף את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של חיץ BSA כדי להסיר את כל מולקולות streptavidin חינם.
לאחר מכן, דללו את הדנ"א של ביוטין למבדה עם מוטיבים משובטים באמצעות חיץ BSA והזריקו אותו ארבע פעמים באיטיות במרווחים של חמש דקות. במהלך ההזרקה, הפעל את המיקרוסקופ במערכת המוליכים למחצה המדעית המשלים של תחמוצת המתכת. לאחר מכן שטפו את הצינורות עם 10 מיליליטר מים מזוקקים כפולים ושטפו את המנסרה ואת מחבר הצינורות במים, 2% מנקה קובט נוזלי ו-99% אתנול.
לאחר מכן, לשאוב לפחות 20 מיליליטר של מאגר הדמיה לתוך מזרק 30 מיליליטר. הניחו את תא הזרימה על במת המיקרוסקופ וחברו אותו למערכת המיקרופלואידית. באמצעות קצב זרימה של 0.03 מיליליטר לדקה, לשטוף את מולקולות הדנ"א למחסום במשך 10 דקות.
לאחר מכן לכבות את המערכת microfluidic לדגור במשך 30 דקות. כאשר הזרימה נעצרת, ומאפשרת לדנ"א להתפזר לרוחב. כדי לדמות את היווצרות העיבוי EWS-FLI1 על וילונות DNA, פתח את תוכנת ההדמיה ומצא וסמן את מיקומן של תשע תבניות הזיגזג תחת שדה בהיר.
לאחר מכן הפעל את הזרימה ב 0.2 מיליליטר לדקה כדי להכתים את הדנ"א עם צבע DNA דו-גדילי במשך 10 דקות. לאחר מכן, דללו את החלבון mCherry EWS-FLI1 עם מאגר ההדמיה בריכוז של 100 ננומולים ב-100 מיקרוליטרים. לאחר מכן טען את דגימת החלבון דרך השסתום עם מזרק זכוכית של 100 מיקרוליטר ושנה את קצב הזרימה ל -0.4 מיליליטר לדקה.
לאחר הפעלת הלייזר בגודל 488 ננומטר יש לסרוק מראש כל אזור כדי לבדוק את מצב התפלגות הדנ"א ולבחור את האזור שבו מולקולות הדנ"א מתפזרות באופן שווה. לאחר מכן הגדר את עוצמת הלייזר ל-10% עבור הלייזר של 488 ננומטר ו-20% עבור הלייזר של 561 ננומטר. ובאמצעות מד הכוח, למדוד את כוח הלייזר האמיתי ליד המנסרה.
התחל להשיג תמונות במרווחים של שתי שניות עם לייזרים של 488 ו- 561 ננומטר בו-זמנית. לאחר מכן שנה את השסתום ממצב ידני למצב הזרקה כדי לאפשר למאגר ההדמיה לשטוף את דגימת החלבון לתוך תא הזרימה לאחר 60 שניות. כדי להסיר את ה-EWS-FLI1 החופשי, המשיכו לשטוף את תא הזרימה עם מאגר ההדמיה למשך חמש דקות כאשר רק הלייזר בגודל 561 ננומטר מופעל.
ואז לעצור את הזרימה לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הפעל את הזרימה במהירות של 0.4 מיליליטר לדקה כדי לאפשר לדנ"א להתרחב ולרכוש תמונות במרווחים של שתי שניות בין מסגרות שונות כדי לקבל נתוני תפוקה גבוהים של היווצרות עיבוי EWS-FLI1. מולקולות EWS-FLI1 הודגמו על ידי זיהוי אותות EWS-FLI1 המסומנים ב-mCherry שהתקבלו באמצעות לייזר בגודל 561 ננומטר.
ניתן להמחיש ישירות את היווצרות המבחנה של עיבוי EWS-FLI1 באתר של 25 חזרות GGAA במצע הדנ"א. הספציפיות של mCherry EWS-FLI1 המשמשת בווילונות דנ"א אושרה על ידי בדיקת תזוזת ניידות אלקטרופורטית באמצעות תבנית דנ"א עם ובלי 25 GGAA חוזר בנפרד. כאשר ריכוז ה-EWS-FLI1 עלה מ-20 ל-500 ננומולים, עוצמת ה-EWS-FLI1 עלתה באופן דרמטי.
בעוד שהשינוי בעוצמת ה-DBD האחת של FLI היה זניח כאשר החלבונים היו רוויים כדי לכסות את ה-GGAA חוזר, מה שמרמז על כך ש-EWS-FLI1 יצר עיבוי על הדנ"א. ההזרקה צריכה להיות איטית ורכה מאוד, כך שהליפוזום והדנ"א יוכלו להתפזר באופן שווה על תא הזרימה. חשוב לבצע MSA כדי לאשר שגורם שעתוק מטוהר נקשר באופן ספציפי לרצף היעד במבחנה.
טכניקה זו מאפשרת לאנשים לחקור אם העיבוי יקל על חיפוש היעד של גורמי שעתוק, והשפעתו על שעתוק.
