Proporcionamos un ensayo de molécula única para observar la separación de fases de los factores de transcripción en el ADN Esta técnica permite la realización en tiempo real del proceso dinámico de los factores de transcripción que se ensamblan como una gota líquida en el ADN. EWS-FL1 es uno de los genes de fusión más frecuentemente implicados en la tumorigénesis del sarcoma de Ewing. Nuestra investigación podría identificar la relación entre el número de motivos de ADN y la formación de condensado EWS-FL1 que se asocia con una transcripción genética estéril en las células tumorales, y tal vez útil para el pronóstico.
Este método podría aplicarse para estudiar cualquier condensado o complejo de transcripción in vitro, como P53 y MED1. Para preparar una celda de flujo con barreras nanofabricadas en zigzag para un experimento de cortina de ADN, conecte los tubos de entrada y salida en la dirección correcta. Luego lave la celda de flujo con 2.5 mililitros de tampón lipídico usando dos jeringas de tres mililitros, asegurándose de que no haya burbujas en la celda de flujo.
Retire la jeringa de la salida e inyecte un mililitro de la solución liposómica tres veces con una incubación de cinco minutos entre cada inyección. Para la curación, vuelva a lavar la celda de flujo con 2,5 mililitros de tampón lipídico lentamente e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Durante la incubación, prepare el tampón BSA como se menciona en el texto manuscrito.
Luego, después de 30 minutos de curación, lave la celda de flujo con 2.5 mililitros de tampón BSA desde el lado de salida. A continuación, inyecte 800 microlitros de tampón de estreptavidina en la celda de flujo desde el lado de entrada en dos pasos con una incubación de 10 minutos después de cada paso. Luego lave la celda de flujo con 2.5 mililitros de tampón BSA para eliminar todas las moléculas de estreptavidina libres.
A continuación, diluya el ADN lambda de biotina con motivos clonados utilizando tampón BSA e inyecte cuatro veces lentamente a intervalos de cinco minutos. Durante la inyección, encienda el microscopio en el sistema semiconductor de óxido metálico complementario científico. Luego lave el tubo con 10 mililitros de agua destilada doble y enjuague el prisma y el conector del tubo con agua, limpiador de cubeta líquido al 2% y etanol al 99%.
A continuación, extraiga al menos 20 mililitros del tampón de imágenes en una jeringa de 30 mililitros. Configure la celda de flujo en la etapa del microscopio y conéctela al sistema microfluídico. Usando un caudal de 0,03 mililitros por minuto, enjuague las moléculas de ADN a la barrera durante 10 minutos.
Luego apague el sistema microfluídico e incube durante 30 minutos. con el flujo detenido, permitiendo que el ADN se difunda lateralmente. Para obtener imágenes de la formación de condensación EWS-FLI1 en cortinas de ADN, abra el software de imágenes y encuentre y marque las posiciones de los nueve patrones en zigzag bajo campo claro.
Luego encienda el flujo a 0.2 mililitros por minuto para teñir el ADN con tinte de ADN de doble cadena durante 10 minutos. A continuación, diluya la proteína mCherry EWS-FLI1 con el tampón de imágenes a una concentración de 100 nanomoles en 100 microlitros. Luego cargue la muestra de proteína a través de la válvula con una jeringa de vidrio de 100 microlitros y cambie el caudal a 0.4 mililitros por minuto.
Después de encender el láser de 488 nanómetros, escanee previamente cada región para verificar el estado de distribución del ADN y seleccionar la región en la que las moléculas de ADN se distribuyen uniformemente. Luego ajuste la potencia del láser al 10% para el láser de 488 nanómetros y al 20% para el láser de 561 nanómetros. Y usando el medidor de potencia, mida la potencia real del láser cerca del prisma.
Comience a adquirir imágenes a intervalos de dos segundos con láseres de 488 y 561 nanómetros simultáneamente. Luego, cambie la válvula del modo manual al modo de inyección para permitir que el tampón de imágenes enjuague la muestra de proteína en la celda de flujo después de 60 segundos. Para eliminar el EWS-FLI1 libre, siga lavando la celda de flujo con el tampón de imágenes durante cinco minutos con solo el láser de 561 nanómetros encendido.
Luego detenga el flujo e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de 10 minutos, encienda el flujo a 0,4 mililitros por minuto para permitir que el ADN se extienda y adquiera imágenes a intervalos de dos segundos entre diferentes fotogramas para obtener datos de alto rendimiento de la formación de condensado EWS-FLI1. Las moléculas EWS-FLI1 se visualizaron detectando las señales EWS-FLI1 marcadas con mCherry obtenidas con un láser de 561 nanómetros.
La formación in vitro de condensado EWS-FLI1 en el sitio de las 25 repeticiones GGAA en el sustrato de ADN podría visualizarse directamente. La especificidad del mCherry EWS-FLI1 utilizado en cortinas de ADN se confirmó mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética utilizando una plantilla de ADN con y sin las 25 repeticiones GGAA por separado. Cuando la concentración de EWS-FLI1 se tituló de 20 a 500 nanomoles, la intensidad de EWS-FLI1 aumentó drásticamente.
Mientras que el cambio en la intensidad de FLI una DBD fue insignificante cuando las proteínas se saturaron para cubrir las repeticiones GGAA, lo que sugiere que EWS-FLI1 formó condensados en el ADN. La inyección debe ser muy lenta y suave para que el liposoma y el ADN puedan distribuirse uniformemente en la célula de flujo. Es importante realizar MSA para confirmar que un factor de transcripción purificado se une específicamente con la secuencia objetivo in vitro.
Esta técnica permite a las personas explorar si el condensado facilitará la búsqueda objetivo de los factores de transcripción y su efecto sobre la transcripción.
