בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תווית כדי ללכוד תמונות של פטריית המודל אספרגילוס nidulans, באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועבר. אנו משתמשים בתמונות אלה כדי לנתח ולכומת קינטיקה צמיחה של nidulans אספרגילוס הן במדיה נוזלית מוצקה. ייצוג חזותי של פרוטוקול זה מאפשר למשתמשים להכיר שלבים משמעותיים של לכידת תמונה ועיבוד תמונה מיקרוסקופית.
שיטה נפוצה המשמשת למדידת צמיחה פטרייתית חוטית היא שני נבגים פטרייתיים מחסן בצלחת פטרי המכילה אגר מיזינים ולמדוד את קוטר המושבה המתפתחת כמה ימים לאחר מכן. עם זאת, גישה זו אינה רגישה מספיק כדי לכמת הבדלי צמיחה עדינים. לכן, מדידות תא בודד באמצעות מיקרוסקופיית זמן לשגות פותחו.
מדידות אלה מסוגלות לא רק לספק תוצאות מדויקות וכמותיות, אלא גם לשקף דינמיקת צמיחה של תאים שונים בתוך אוכלוסייה. יתר על כן, גישה זו שואפת להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בתגובות צמיחה פטרייתיות לאותות אנדוגניים וסביבתיים. התחל על ידי שפיכת 15 מיליליטר של אגר מיזים נוזלי לתוך מנות פטרי.
מניחים את המכסה על החלק העליון ומאפשרים לו להתקרר. השתמש בקרינת UV כדי לעקר צלחות. לפני פסים את המתח הפטרייתי של עניין מן המניה, לחמם את לולאת הנהון מבער Bunsen עד שהוא חם אדום, לקרר את הלולאה על ידי דקירתו לתוך אגר.
מערבולת את הצינור ופס הלולאה על פני השטח של המדיום המינימלי אגר בתוספת הדרישות התזונתיות המתאימות. לוחות דגירה במשך יומיים עד שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. באמצעות קיסם סטרילי, להעביר מספר קטן של conidia על ידי נגיעה עדינה מושבה אחת לצלחות של מדיה מלאה.
לוחות דגירה במשך שלושה עד ארבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. Conidia של nidulans אספרגילוס, נקצרים בצינור מערבולת סטרילי 1.5 מיליליטר, עם 1.0 מיליליטר של מים מזוקקים autoclave המכיל 0.05% נפח לכל נפח, Tween 80, להפחתת מספר גושי conidia. גרסה מותאמת של שיטת אגר הפוכה משמשת להדמיית פטריות חוטיות על משטח בינוני אגר.
בתחילה לזהות 10 aliquots microliter של השעיה conidial מערבולת נמרצת, בערך פעמיים 104 תאים למיליליטר על מנות פטרי של 15 מיליליטר בינוני מינימלי עם משקל אחד לכל אגר נפח. לדגור על התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שיש לחקור. כאן אנו מדגירים במשך שלושה ימים ב 30 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, פרוס בלוק של אגר המכיל את המושבה, באמצעות אזמל סטרילי. כאן אנחנו חותכים טריז של אגר בשולי המושבה, להפוך ולהניח את פרוסת אגר לשמונה, גם להחליק. העבר 10 aliquots microliter של השעיה conidial מערבולת נמרצת של כ פעמיים כפול 10 בכוח של ארבע בבארות של שקופית באר המכילה 200 microliters של בינוני מינימלי עם תוספי המתאים.
דגירה לזמן ולטמפרטורה שיש לבדוק בכל פעם. הבחירה במיקרוסקופ תלויה בציוד הזמין. בכל מקרה, המיקרוסקופ שהוקם צריך לכלול שלב הפוך, תא סביבתי, או לפחות חדר עם בקרת טמפרטורת אוויר מדויקת.
בתחילה לחמם את התרמוסטט ואת תא המיקרוסקופ כדי לייצב את הטמפרטורה הרצויה. כאן אנו קובעים את הטמפרטורה על 30 מעלות צלזיוס. הפעל את המיקרוסקופ, את כוח הסורק, את כוח הלייזר והמחשב, וטען את תוכנת ההדמיה.
מקם את החלקה המוכנה היטב שהוכנה בעבר בשלב המיקרוסקופ ובמוקד. מצא שדות תצוגה המכילים תאים מבודדים, לא חופפים, או לפחות לא צפופים, כדי להקל על מדידות צמיחה במהלך ניתוח תמונה. בחר את טכניקת מיקרוסקופיית האור המשודרת לשימוש ולהפעיל את גלאי האור המשודר, כמו גם גלאים עבור פלואורסצנטיות בעת הצורך.
הגדר את המיקרוסקופ כדי לרכוש תמונות במרווחי זמן רצויים ולהתחיל את רכישת סדרת זמן. טעינה, תצוגה חזותית ועיבוד של תמונות מתבצעת עם תוכנת קוד פתוח של ג'יי פיג'י. התחל על-ידי ייבוא התמונות לפיג'י באמצעות תוספים בתבנית.
בחר את מצב הצבע וקנה המידה האוטומטי המהווים ברירת מחדל. כדי לדמיין חותמת זמן וסרגל קנה מידה כשכבת-על עבור לנתח, כלים, סרגל קנה מידה. הגדר את הפרמטרים הרצויים לגבי רוחב, גובה, צבע ומיקום של סרגל קנה המידה.
עבור אל תמונה, מאפיינים, כדי להציג מאפייני תמונה בתוכנת imageJ Fiji. שים לב למידע מרווח המסגרות. כאן אנו משתמשים במרווח זמן של כ -15 דקות ולחצו בסדר.
לאחר מכן עבור אל תמונה, ערימות, תווית והגדר את המידע הנכון למרווח זמן. הגדר את מיקום התווית על-ידי שינוי X ו- Y.הגדר את יחידת המדידה בטקסט השדה ולחץ על תצוגה מקדימה. השתמש בהתאמת היסטוגרמה לתיקון תאורה בין מסגרות שונות על-ידי בחירת תמונה, כוונון, תיקון אקונומיקה, התאמת היסטוגרמה.
מופיע חלון חדש עם תאורה מתוקנת. השתמש תוסף MtrackJ בתוספים, MtrackJ, כדי לעקוב אחר קצה hyphal גדל כדי להוסיף את הרצועה, בחר את לחצן הוספה בסרגל הכלים ומקם את הנקודה הראשונה בקצה hyphal באמצעות הלחיצה השמאלית של העכבר. סידרת הזמן תעבור באופן אוטומטי למסגרת הבאה.
כדי להשלים את תהליך המעקב, לחץ פעמיים על העכבר בנקודה הסופית או הקש על מקש המילוט. גלילת טבלת הפלט, העמודה החשובה ביותר לחישוב צמיחת קצה ההיפהל, היא המהירות בכל מסגרת נתונה. מעקב בטוח אחר מדידות, הוספת קובץ, שמירה כ, לתבנית הקובץ לפי בחירתך, לדוגמה, CSV, ייבוא הקובץ השמור לתוכנית הגיליון האלקטרוני שלך וחישוב הפריט החזותי ובדיקות נוספות.
לחץ על לחצן הסרט כדי ליצור סרט, סוג צבע RGB, המכיל את המסגרות עם הרצועות שצוירו לתוכם, אשר ניתן לדמיין בכל נגן מולטימדיה סטנדרטי. בעקבות פרוטוקול זה, תפסנו וניתחנו תמונות שונות המתאימות לשלבי צמיחה והתפתחות שונים של הפטרייה הסיבית אספרגילוס nidulans. איור מציג את ההשוואה של מדידות קצב הצמיחה של סוג הבר וקצב הצמיחה של דלתא של azhAD Delta.
דלתא דלתא azhAD דלתא היא זן שנמחק כפול בשני גנים מעורבים ניקוי רעלים והטמעה של מוצר הלוחם הרעיל L כפי שנוספו בשתי חומצה קרבוקסילית. זה מראה מדידות קצב צמיחה נמוכות משמעותיות סטטיסטית בהשוואה לזן סוג הבר בתרביות נוזליות שקועות. הבדל זה בצמיחה אינו ניתן לזיהוי על ידי מדידת אזור המושבה של שני זנים אלה במדיום מינימלי מוצק.
לתא יחיד, הדמיה חיה לטווח ארוך יש ערך משמעותי במאמץ להשיג מידע מרחבי וטמפורלי של דינמיקת חלבונים תאיים. פרוטוקול זה מתאים גם לביצוע הדמיה ארוכת טווח של תאים חיים. כאן אנו רואים נביטה של conidia שיתוף מבטא את GFP שכותרתו חלבון eisosomal הליבה PilA ואת היסטונן mRFP H1. כאן אנו מציגים פרוטוקול לניתוח קינטיקה גדילה פטרייתית באופן לשחזור ואמין ללא צורך בכל ניסיון ניתוח תמונה קודם מהמשתמש.
פרוטוקול זה מאפשר כימות מדויק אובייקטיבי של צמיחה פטרייתית.
