В этом видео мы описываем протокол визуализации в реальном времени без меток для захвата изображений модели гриба aspergillus nidulans с использованием методов микроскопии пропускаемого света. Мы используем эти изображения для анализа и количественной оценки кинетики роста нидуланов aspergillus как в жидких, так и в твердых средах. Визуальное представление этого протокола позволяет пользователям ознакомиться со значительными этапами захвата изображений и обработки изображений в микроскопии.
Распространенным методом, используемым для измерения роста нитевидных грибов, является две инокулированные споры грибов в чашке Петри, содержащей питательный агар, и для измерения диаметра развивающейся колонии через несколько дней. Однако этот подход недостаточно чувствителен для количественной оценки тонких различий в росте. Поэтому были разработаны одноклеточные измерения с использованием покадровой микроскопии.
Эти измерения способны не только обеспечить точные и количественные результаты, но и отразить динамику роста различных клеток внутри популяции. Кроме того, этот подход направлен на лучшее понимание молекулярных механизмов, участвующих в реакциях роста грибов на эндогенные и экологические сигналы. Начните с того, что налейте 15 миллилитров жидкого питательного агара в чашки Петри.
Положите крышку сверху и дайте ей остыть. Используйте ультрафиолетовое излучение для стерилизации пластин. Прежде чем вытащить интересующий грибковый штамм из бульона, нагрейте узелковую петлю в горелке Бунзена, пока она не нагреется, охладите петлю, вонзив ее в агар.
Вихрь трубки и продените петлю по поверхности агарова минимальной средой, дополненной соответствующими требованиями к питанию. Инкубировать плиты в течение двух-трех дней при 37 градусах Цельсия. Используя стерильную зубочистку, перенесите небольшое количество конидий, осторожно коснувшись одной колонии к пластинам полной среды.
Инкубировать пластины в течение трех-четырех дней при 37 градусах Цельсия. Конидии аспергиллуса нидуланов собирают в стерильной 1,5-миллилитровой вихревой трубке, с 1,0 миллилитрами автоклавной дистиллированной воды, содержащей 0,05% объема на объем, Tween 80, для уменьшения количества сгустков конидий. Модифицированный вариант метода инвертированного агара используется для визуализации нитевидных грибов на поверхности агартовой среды.
Первоначально обнаружите 10 микролитровых аликвот энергично вихревой конидиальной суспензии, примерно в два раза по 104 клетки на миллилитр на чашках Петри из 15 миллилитров минимальной среды с одним весом на объем агара. Инкубировать экспериментальную культуру в соответствии с исследуемой стадией развития. Здесь мы высиживаем в течение трех дней при 30 градусах Цельсия.
После этого вырежьте блок агара, содержащий колонию, используя стерильный скальпель. Здесь мы вырезаем клин агара на краю колонии, переворачиваем и помещаем ломтик агара в восьмерку, хорошо скользящую. Перенесите 10 микролитровых аликвот энергично вихревой конидиальной суспензии примерно в два раза по 10 в степени четырех в скважины горки скважины, содержащей 200 микролитров минимальной среды с соответствующими добавками.
Инкубировать в течение времени и температуры, которые будут исследоваться каждый раз. Выбор микроскопа зависит от имеясь оборудования. В любом случае, установленный микроскоп должен включать в себя перевернутую ступень, камеру окружающей среды или, по крайней мере, комнату с точным контролем температуры воздуха.
Первоначально предварительно разогрейте термостат и камеру микроскопа для стабилизации нужной температуры. Здесь мы устанавливаем температуру на уровне 30 градусов по Цельсию. Включите микроскоп, питание сканера, мощность лазера и компьютер и загрузите программное обеспечение для обработки изображений.
Поместите предварительно хорошо подготовленный слайд в стадию микроскопа и сфокусироваться. Найдите поля зрения, которые содержат изолированные, не перекрывающиеся клетки или, по крайней мере, не переполненные, чтобы облегчить измерения роста во время анализа изображений. Выберите метод микроскопии пропускаемого света, который будет использоваться, и активируйте детектор пропускаемого света, а также детекторы для флуоресценции, когда это необходимо.
Установите микроскоп для получения изображений через нужные промежутки времени и начните сбор временных рядов. Загрузка, визуализация и обработка изображений осуществляется с помощью программного обеспечения imageJ Fiji с открытым исходным кодом. Начните с импорта изображений на Фиджи с помощью плагинов в формате.
Выберите цветовой режим по умолчанию и автоматическое масштабирование. Для того чтобы визуализировать метку времени и шкалу масштаба в качестве наложения перейдите к анализу, инструментам, шкале масштаба. Задайте необходимые параметры, касающиеся ширины, высоты, цвета и расположения шкалы.
Перейдите к изображению, свойствам, чтобы отобразить свойства изображения в программном обеспечении imageJ Fiji. Соблюдайте информацию об интервале кадров. Здесь мы используем временной интервал примерно 15 минут и нажимаем ok.
Затем перейдите к изображению, стекам, метке и установите правильную информацию на интервал. Задайте расположение метки, изменив X и Y.Задайте единицу измерения в тексте поля и нажмите кнопку предварительного просмотра. Используйте сопоставление гистограмм для коррекции освещенности между различными кадрами, выбирая изображение, корректируя, отбеливая коррекцию, сопоставление гистограммы.
Появится новое окно с исправленной подсветкой. Используйте плагин MtrackJ в плагинах, MtrackJ, чтобы отслеживать растущую подсказку гифаля Чтобы добавить трек, выберите кнопку добавления на панели инструментов и поместите первую точку в подсказку гифала левым щелчком мыши. Временной ряд автоматически перейдет к следующему кадру.
Чтобы завершить процесс отслеживания, дважды щелкните мышью по конечной точке или нажмите клавишу escape. Прокрутка выходной таблицы, наиболее важного столбца для расчета роста гифальной кончики, - это скорость в любом заданном кадре. Безопасно отслеживайте измерения, добавляйте файл, сохраняйте как, в формат файла по вашему выбору, например, CSV, импортируйте сохраненный файл в свою программу для работы с электронными таблицами и вычисляйте визуализацию и дальнейшие тесты.
Нажмите кнопку фильма, чтобы сгенерировать фильм, цветной тип RGB, содержащий кадры с нарисованными в них дорожками, которые можно визуализировать в любом стандартном мультимедийном проигрывателе. Следуя этому протоколу, мы захватили и проанализировали различные изображения, соответствующие различным стадиям роста и развития нитевидных грибов aspergillus nidulans. На рисунке показано сравнение измерений скорости роста дикого типа и azhAD Delta ngnA Delta.
AzhAD Delta ngnA Delta представляет собой двойной удаленный штамм в двух генах, участвует в детоксикации и ассимиляции токсичного истребителя продукта L, добавленного в две карбоновые кислоты. Он показывает статистически значимые более низкие измерения скорости роста по сравнению со штаммом дикого типа в погруженных жидких культурах. Эта разница в росте не обнаруживается путем измерения площади колонии этих двух штаммов в твердой минимальной среде.
Одноклеточная, долгосрочная живая визуализация имеет существенное значение в усилиях по получению пространственной и временной информации динамики клеточных белков. Этот протокол подходит также для проведения долгосрочной визуализации живых клеток. Здесь мы видим прорастание конидий, совместно экспрессирующих меченый GFP основной эисомальный белок PilA и mRFP histonen H1. Здесь мы представляем протокол для анализа кинетики роста грибов воспроизводимым и надежным способом без необходимости какого-либо предварительного опыта анализа изображений от пользователя.
Этот протокол позволяет объективно точно определить рост грибков.
