מודל הדמיה יילודים של אלח דם חיידקי גרם שלילי

הפרוטוקול שלנו מאפשר הפצת חיידקים ומעקב אחר נטל במודל אלח דם יילודים ניסיוני בזמן אמת, ואת היכולת לתאם סמנים אחרים של מחלה עם נטל הפתוגן. פרוטוקול זה מאפשר לנו לנתח אורך אלח דם בעכברים יילודים בודדים, מתן הזדמנות להתבונן ולהשוות דינמיקת זיהום והפצה חיידקית בזמן אמת. בדיקה פרה-קלינית של התערבויות לאח דם יילודים יכולה להתבצע בשיטה זו, המאפשרת ניטור של ההשפעות של שליטה מארחת של החיידקים.

התחל על ידי הצבת גורים תואמי גיל לקבוצות פסולת במינון גבוה או נמוך בתוך ארון ברמה biosafety שני. ביום שלאחר הלידה שלוש או ארבע, להקליט את המשקולות של כל הגורים לפני החיסון. לטעון מזרקי אינסולין עם PBS או מינון גבוה או נמוך E.coli לוקס inoculum ב ארון biosafety ולהמקם את המזרקים טעון על קרח.

מניחים את הניאון להיות מוזרק על משטח נקי בתוך ארון biosafety ולהרים את העור בעורף הצוואר כאילו כדי לגרד את הגור. הכנס את המחט משופעת ממש מתחת לעור בחלל שנוצר בין העור לשריר. כאשר המחט יכולה להיות מורגשת מתחת לעור, להזריק 50 microliters של inoculant בעת ובעונה אחת לשחרר את החלק הצבט של העור כדי למנוע זרימה אחורית, ולאחר מכן להסיר את המחט לאט ובזהירות.

כאשר כל הגורים הוזרקו באותו אופן, להחזיר את הגורים לסכרים שלהם. מיד לאחר ההזרקה ובנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות לאחר מכן, מניחים את הכלוב עם עכברי יילודים נגועים E.coli וסכר לתוך מכסה המנוע זרימה biosafety רמה 2 למינאר ולפתוח את התוכנה במחשב CT מיקרו. לאחר אתחול המערכת והמתנה לטמפרטורת הבמה לנעול ב 37 מעלות צלזיוס וטמפרטורת CCD לנעול ב 90 מעלות צלזיוס שלילי, מניחים עד ארבעה גורים הרדמה על תיבת ההדמיה בתא ההדמיה במצב נוטה.

סגור את דלת תא ההדמיה ובחר באפשרות הדמיית זוהר. בחר מסנן פתוח ולאחר מכן והגדר את מסנן העירור לחסימה ואת מסנן הפליטה לפתיחה. בחר 500, 520, 560, 580, 600 ו- 620 ננומטר.

ואז תמונה הגורים לפני החזרתם לכלוב עם הסכר עם ניטור עד התאוששות הרדמה. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, בארון biosafety, לשים את הניאון המתת חום עם 70%אתנול כדי למנוע זיהום ולהניח את החיה בצד ימין שלה. השתמש מדפים כדי לתפוס את העור בין הבטן ורגל שמאל האחורית ולהשתמש מספריים כירורגיים קצה דק לעשות חתך בעור.

ואז להמשיך חתך לכיוון החלק האחורי של החיה עד הטחול כולו נחשף. השתמש במטסים ומספריים כדי להסיר את הטחול מהבטן ול למקם אותו בתתק המתאים ליישום במורד הזרם שלה. כדי להשיג את הריאות, לקלף בחזרה את העור של החזה לחלוטין להיכנס בבסיס עצם החזה עם המספריים מוחזק אנכית, לחתוך כלפי מעלה עד שכלוב הצלעות מתפצל.

השתמש במקלפים כדי לתפוס את הריאות הימנית והשמאלית בנפרד ולהסיר את הריאות חלל בית החזה. הסר את הלב מרמת הריאה עם מספריים. ואז למקם את הריאה בתסרון המתאים ליישום במורד הזרם שלה.

כדי לבצע בדיקה להריגת חיידקים במבחנה, הנח את הטחול הבלתי מוקטן בתוך מסננת ניילון 40 מיקרומטר בתוך צלחת פטרי סטרילית של 60 מ"מ המכילה חמישה מיליליטר של PBS בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ולהשתמש בבוקר מזרק סטרילי של שלושה מיליליטר כדי לפרק את הרקמה לתוך מתלה תא יחיד. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה. תן מחדש את גלולת במיליליטר אחד של חיץ תותבת תא דם אדום לכל שלושה עד ארבעה טחול.

לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את הטחול ב- PBS ולתלות מחדש את גלולה ב 250 microliters של PBS בתוספת אלבומין סרום בקר ושני EDTA מילימולאר לספירה. לאחר מכן, לבודד את התאים החיוביים Ly6 B2 עם חרוזי immunomagnetic המתאים על פי פרוטוקול היצרן וזרע את התאים החיוביים מועשר Ly6 B2 באחת פעמים 10 לחמשת התאים לכל 100 microliters של בינוני מלא לכל צפיפות גם בצלחת 96 באר שחור או לבן. הכינו את האינוקולום החיידקי בריבוי הזיהום הרצוי בנפח סופי של 100 מיקרוליטרים ל הבאר והוסיפו 100 מיקרוליטרים של אינקולום חיידקי או בינוני לבדו לכל באר עבור אינקובציה של שעה באינקובטור תרבות התאים.

בסוף הדגירה, החלף את המדיום עם 200 microliters של מדיום שלם טרי בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר של ג'נטמיצין כדי להסיר את כל החיידקים החוץ תאיים הנותרים ולהחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך שעתיים נוספות. בסוף הדגירה ובכל נקודת זמן ניסיונית לאחר מכן, השתמש בקורא לוחות כדי למדוד את הזוהמה בכל באר של צלחת התרבות השוממת לפני החזרת הצלחת לחממת תרבות התא עד הקריאה הבאה. בעוד שרוב בעלי החיים מפגינים רמות גבוהות של חיידקים בדם ב 24 שעות לאחר ההדבקה, כמה גורים יש חיידקים נמוכים או בלתי ניתנים לגילוי בדם, מה שמרמז על אישור הזיהום על ידי נקודת זמן זו.

בנוסף, יילודים Ly6 B2 תאים טחול חיובי נגוע bioluminescent E.coli במשך שעה אחת לפני הסרת חיידקים חוץ תאיים וטיפול ג'נטמיצין הבאים הביע רמה גבוהה של זוהר בשלוש שעות זה פוחת לאורך זמן מעיד על סיווג חיידקי. הדמיה חיה של בעלי חיים של חיידקים זוהרים מאשרת עוד יותר את העלייה בהפצת חיידקים וצמיחה של גורי יילודים לאורך זמן ב 10 ו 24 שעות לאחר ההדבקה. הדמיה תוך-ויטמינים בשילוב עם מיקרו CT מקלה על זיהוי מוקדי זיהום בתוך המוח, הריאות ורקמות היקפיות אחרות.

הריאות של כמה עכברים נגועים מאוד להפגין אזורים אטומים עולה בקנה אחד עם איחוד דלקתי כי במשותף מקומי אותות חיידקיים זוהרים. אזורים אלה של exudate דלקתי המשוער אינם נצפו בריאות שליטה לא מובחנים. עלייה משמעותית בביטוי ציטוקיני דלקתי ביחס לפקדים נצפתה גם בקבוצות אינוקולום נמוכות וגבוהות, המתואמת עם עיבוי בולט של קיר מכתש, דימום מכתש מוגבר וחדירה דלקתית בבעלי חיים אלה.

הדברים החשובים ביותר שיש לזכור הם לבצע טכניקה נכונה בעת ביצוע הזריקות ולהקדיש תשומת לב קפדנית לרימונים בעת מתן ההרדמה. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לדמיין אלח דם יילודים בזמן אמת כדי ללמוד התערבויות ולארח טיפולים מכוונים שמטרתם לשפר את התגובה החיסונית.