מודל תרחיף cecal עבור אלח דם polymicrobial הוא כלי רב עוצמה לנתח את הפתופיזיולוגיה יילודים ייחודי. זה יכול להיות משתנה, ונקודות קצה אנושיות אינן מתוארות היטב. כאן אנו מציגים את ההליך הסטנדרטי ביותר שלנו כדי להכין תרחיף cecal ולהזריק לתוך בעלי חיים ניסיוניים.
יתר על כן, אנו משתמשים בגישה מונחית נתונים כדי לזהות גורים מורביונדיים בנקודת הזמן המוקדמת ביותר האפשרית. בואו נתחיל על ידי הכנת מלאי תרחיף cecal קפוא. זה נעשה על ידי רכזת cecal מלפחות חמישה עכברים בוגרים, השעיה במים דקסטרוז סטרילי, ואחסון במינוס 80 לשימוש מאוחר יותר.
אתה יכול להשתמש זכרים או נקבות, אבל המין, הגיל, והרקע של עכברים לניסויים שלך צריך להישמר קבוע. ראשית, בואו להכין את הכלים שלנו לנתח. אלה כוללים קבוצה של מספריים ומדפים לעור וקבוצה שנייה לאיברים הפנימיים.
הפעל את חיטוי חרוזים חם לפחות 30 דקות לפני השימוש. טובלים את הכלים ב-70% אתנול ואז טובלים אותם בחיטוי החמים במשך דקה אחת לפחות. ריסוס מחצלת של מגבות נייר עם 70% אתנול, ולאחר מכן להסיר את הכלים מן מעקר מבלי לגעת בחלק מעקר של הכלי לידיות לא סטריליות של כלים אחרים.
מניחים אותם על מגבת הנייר כדי להתקרר. לנתח את העכברים בארון בטיחות ביולוגי. הצמד את הרגליים של העכבר ללוח קלקר באמצעות 23 מחטי מד כך העכבר הוא בטן למעלה.
לרסס את הבטן עם 70% אתנול. באמצעות מטלאים סטריליים ומספריים, לחתוך דרך העור, לשחרר את העור מן הציפוי הציפוי עם המספריים, לחתוך לפתוח אזור מלבני מן המפשעה אל עצם החזה ואת הצד השמאלי לצד ימין. הסר כל פרווה סביב ההברה.
עבור לזוג חדש של כלים סטריליים כדי לחתוך דרך peritoneum, גם עושה פתח מלבני. זהה את cecum, אשר צריך להיות פועל בצד שמאל לצד ימין על פני הגוף. לשבש את רקמת החיבור כדי לזהות את ענפי cecum מהמעיים לחתוך את cecum מן המעיים.
מניחים אותו על גיליון מעוקר של נייר שקילה. באמצעות כלים סטריליים, לחתוך דרך שני הקצוות של cecum. החזק את אמצע cecum עם מדחפים ולהשתמש מרית מתכת שטוחה בעדינות לדחוף את התוכן cecal מתוך הקצוות באמצעות תנועה מתגלגלת.
לאסוף את התוכן ול למקם אותם בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר שקל מראש. תכולת סקל בריכה מחמישה עכברים לכל היותר לאותו צינור. משקל הצינור שוב פעם כל התוכן נוספו.
כדי לחשב את נפח המים dextrose להוסיף לתכולת cecal בכל צינור, לחלק את המשקל של תכולת cecal בצינור על ידי הריכוז הרצוי שלך מיליגרם למיליליטר. שמור aliquot של מים דקסטרוז על קרח להשעיה מחדש של תוכן cecal. הוסף את הכמות הנדרשת של מים דקסטרוז לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל תוכן cecal.
מערבולת הצינור אנכית ואופקית במשך כ -30 שניות. שימו לב לנוכחות של חלקיקים בקוטר של כמה מילימטרים, ואם הם נוכחים, המשיכו במערבולת עד שכל החלקיקים ייעלמו בעליל. מניחים צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על קרח כדי לאסוף את הסינון ולהתקין מסננת תא סטרילי 70 מיקרומטר מעל.
פיפטה ארבעה מיליליטר של תרחיף מושעה מחדש מצינור אחד 15 מיליליטר מעל מסננת התא לתוך צינור האיסוף. להשעות מחדש את החלקיקים על ידי צינור למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים. בעדינות להדר בועות כדי להגביר את מהירות הסינון תוך ערבוב התוכן עם קצה פיפטה עד שאין יותר נוזל להיות מסונן.
זה אמור לקחת בערך 30 שניות. לשנות מסנני תאים בין כל צינור של תרחיף cecal, אבל בריכת כל התוכן לאותו צינור איסוף 50 מיליליטר. אם המניה שלך עולה על 40 מיליליטר, אז מערבולת זה במשך 15 שניות, ולמקום 20 מיליליטר לתוך צינור צנטריפוגה חדש.
מחלקים את תרחיף לתוך בקבוקונים קריוגניים של 500 aliquots microliter כל אחד. וורטקס תרחיף בין כל שלושה בקבוקונים. שמור את מלאי האב בבקבוקונים על קרח.
על ידי אחסון aliquots במינוס 80, המושבה האירובית להרכיב ריכוז יחידה בהכנה תרחיף cecal אינו משתנה על פני תקופה של שישה חודשים. עכשיו, כאשר תרחיף cecal מוכן, אנחנו יכולים להשתמש בו כדי לאתגר המלטה של עכברים בני שבעה עד שמונה ימים עם מנה מותאמת משקל של תרחיף cecal. הקטלניות של תרחיף תלוי מינון.
תצטרך לקבוע את המינון הקטלני הרצוי במתקן שלך עבור כל מלאי חדש עם טיטריון מינון חדש. אליקוט הזרקת סקל אחד מוכן לכל המלטה. אנחנו מנרמלים את האינוקולום לנפח של 100 מיקרוליטר, ומעגלים ל-10 המיקרוליטרים הקרובים ביותר לכל בעל חיים בפסולת.
הכנת אתגר aliquot דורש שלושה חישובים, נפח מלאי תרחיף נדרש, נפח נוסף של מים dextrose, ואת נפח מעוגל עבור כל גור בפסולת. פרטים על אופן הביצוע של כל חישוב ניתן למצוא בסעיף 3 של הפרוטוקול. ביצוע חישובים אלה ביד עבור כל ניסוי יכול להיות זמן רב יתרום שגיאה ניסיונית, ולכן גיליון אלקטרוני ניתן להוריד יחד עם הפרוטוקול שבו אתה קלט ריכוז המלאי שלך, המינון הרצוי, ואת המשקל של המלטה שלך, ואת כמות מלאי תרחיף, נפח של מים דקסטרוז, נפח בפועל לכל גור מוחזר באופן אוטומטי.
אתה יכול להדפיס את הגיליון הזה ולקחת אותו איתך כאשר אתה מוכן לאתגר את בעלי החיים שלך. הכינו את ההזרקה לארון בטיחות ביולוגי והמשיכו על הקרח. לפני טעינת המזרק, מערבבים את צינור המיקרוצנטריפוגה על ידי תנועה 20 פעמים.
גורים מאותגרים עם מזרק אינסולין 28 מד. לפני ציור תרחיף, מערבבים את aliquot על ידי השראה ופלט 300 כדי 500 microliters של aliquot האתגר פנימה ומחוץ צינור microcentrifuge. לאחר מכן, צייר בערך 150 מיקרוליטרים של אליטוט האתגר.
זה צריך להיות גדול יותר מנפח ההזרקה עבור כל גור בן שבעה עד שמונה ימים. פליק על המזרק כדי לסלק בועות מן הבוכנה ולמשוך בחזרה מעט על המזרק כדי לגרש את כל בועות האוויר. אין לגעת במחט או בפיר הבוכנה במהלך תהליך זה.
לוותר על תרחיף cecal עודף בחזרה לתוך צינור microcentrifuge עד הכמות המחושבת של תרחיף cecal לעכבר נטען לתוך המזרק. תרחיף Cecal מנוהל עם זריקה תוך-ניתוחית. בצע זאת בהתאם לפרוטוקול במוסד לטיפול בבעלי חיים שלך.
כדי למזער את הדליפות, להטות את הגור כלפי מטה ולהכניס את המחט בין הרגל לבין איברי המין, שמירה על המחט רדוד תת עורית. לאחר החדרת המחט על סנטימטר אחד, לחץ כלפי מטה וקדמת עד שאתה מרגיש את המחט לנקב את peritoneum, ואז לאט לדכא את הבוכנה. בזהירות למשוך את המחט בעקבות אותו המסלול כפי שנכנסת, מרגיע את האצבע האמצעית שלך כפי שאתה עושה זאת.
שים לב לדליפות במחברת המעבדה שלך ושקול להשמיט בעלי חיים עם דליפות משמעותיות מהתוצאה הסופית שלך. בסעיף זה יתווה את רמות הבריאות השונות שאנו רואים בעכברים מאותגרים עם אלח דם פולימיקרוביאלי ונקודת הקצה האנושית המתאימה שלהם. עבור כל נהלים הקשורים לעכברי יילודים, אנו מעבירים את חומר המצעים לכלוב חדש.
זה מעביר את הריח של הגברת על הכפפות שלך ומפחית את הלחץ על הגברת מכניסה חוזרת ונשנית לכלוב שלה. אנחנו עושים קן שני בכלוב החדש כדי להחזיק את הגורים המנוטרים עד סוף ההליך או ניטור כאשר המלטה כולה מוכנה לחזור לכלוב של הגברת. מקם עכבר על גבו ונטר את היכולת לימין בתוך ארבע שניות.
אם זה יכול להיות נכון, אז לחכות שמונה שניות נוספות כדי לקבוע את רמת הניידות. עכבר ללא עוררין או משחזר הוא לרוב מסוגל נכון ולחקור את הסביבה שלה על ידי נקיטת צעדים מרובים ברציפות. לארגן מחדש עכברים שמצליחים ליישר את עצמם ולנקוט כמה צעדים כדי לחקור את הסביבה שלה כזכויות רדום.
עכברים אלה עלולים ליפול תוך כדי צעד ולהסתכל רעוע על רגליהם. עכבר שאינו מסוגל לימין ויש לו תנועת ירך העולה על 90 מעלות אופקית אנו מקובצים ככישלון לימין נייד. העכבר הזה בסופו של דבר ימינה אבל לא יכול בתוך ארבע שניות.
בגלל תנועות הירך שלה, הוא מקובצים כמו להיכשל ימינה ניידים. גורים שלא הצליחו לימין ויש להם תנועת ירך מתחת ל -90 מעלות מהאופקי מקובצים ככישלון לימין רדום. זוהי דוגמה נוספת לעכבר שירכיו אינן עולות על 90 מעלות מהאופקי ומקובץ ככישלון לימין רדום.
לא מצליח גור ימני-nonmobile יהיו רגליים שעשויות לרעוד או לרטוט אבל אין תנועת הירך. הגפיים עשויות להאריך ולחזור, אך לא תהיה להן תנועה אומאוחרת. הגור חולה בעליל והגיע לנקודת הקצה ההומנית.
זוהי דוגמה נוספת לכישלון של גור ימני ללא תנועה. ירכיו אינן רועדות משמאל לימין, אך כפותיו רוטטות. כאשר מטפלים בכלוב של הגברת, גורים יכולים להיגרר מהקן אם הגברת הסיעודית רצה.
אנחנו מחליפים אותם ואז בודקים גורים מפוזרים אחרים שנמצאים הרחק מהקן שלהם. אם הגורים המפוזרים האלה אינם מנומנם נכון, הם נמצאים בנקודת קצה אנושית. הנה עקומת הישרדות קפלן-מאייר של מודל אלח דם שלנו.
ניתן למצוא את נקודות זמן הניטור ב- SOP המצורף. בכל נקודה לאורך עקומת ההישרדות אם עכבר נמצא להיכשל לימין-nonmobile, הוא בנקודת הקצה האנושית שלה המתת דם. בין 12 ל -21 שעות לאחר האתגר, עכברים ייראו חולים וכמחצית מהעכברים יוכלו ממש בצד אחד, בעוד החצי השני לא מצליח ממש משני הצדדים שלהם.
זוהי מסגרת הזמן שבה העכברים יתחילו לסטות בניקוד הבריאות ולהגיע לנקודת הקצה האנושית של אי-תנועה ימנית. אלה תוצאות מייצגות של ציוני בריאות שנצפו במסגרת זמן זו. בשלב זה לא ניתן להבדיל בין קבוצות הניצולים לבין קבוצות שאינן ניצולות על סמך ציוני הבריאות שלהן.
בשלב זה של המחלה, 21 עד 48 שעות לאחר האתגר, אנו רואים את השיעור הגבוה ביותר של נקודות קצה אנושיות. ראינו גם כי הרוב המכריע של כל העכברים שאינם מסוגלים לימין משני הצדדים לא בסופו של דבר מחלים ממחלה, אשר ולכן הופך קריטריונים חדשים עבור נקודת קצה אנושית בנוסף להיכשל קריטריונים ימניים ללא תנועה. הציונים הבריאותיים שנצפו בשלב זה של המחלה גרמו להפרדת ניצולים מבלתי ניצולים.
הרוב המכריע של העכברים שלא הצליחו לימין משני הצדדים לא החלימו ממחלה. נתונים אלה תומכים גם קריטריון חדש עבור נקודת קצה אנושית החל מ 21 שעות לאחר האתגר צריך להיות המתת דם כל עכברים להיכשל ימינה משני הצדדים. במשך 48 שעות לאחר האתגר עכברים רבים יתחילו להציג יותר פעילות רפלקס ימין טוב יותר.
למרות ששיעור נקודות הקצה האנושיות נמוך יותר בתקופה זו, העכברים עדיין יכולים לחפות ולהיות חולים יותר, והם עדיין דורשים ניטור לנקודת קצה הומנית. במהלך פרק זמן זה, חלק מאותם עכברים שבסופו של דבר היו מקובצים כלא ניצולים הראו פעילות מוגברת בשלב מסוים, אך מאוחר יותר עשו גרוע יותר והגיעו לנקודת קצה הומנית. זה מחייב המשך ניטור של בעלי חיים חולים בתדירות מוגברת אם הם מתחילים להציג תוצאות בריאותיות גרועות יותר.
ניסויים עצמאיים שלא קיבלו הכשרה פנים אל פנים ורק צופים בסרטון הדרכה זה נבדקו ביכולתם להקצות את אותו ציון כמו החוקרים באמצעות סרטוני מבחן מוקלטים. סרטון הדרכה זה מביא לסיווג התנהגותי מדויק. היכולת להקצות את הציון הנכון כדי להיכשל בעכברים יילודים ימניים שאינם ניידים, שהיא מדד לנקודת קצה הומנית, נקבעה מתוך 60 עכברי יילודים, ו-97% בממוצע מההתנהגויות נבדלו במדויק, כאשר רק 3% זוהו באופן שגוי.
לאחר מכן, נבדקה היכולת להבדיל בין עכברי יילודים שלא הצליחו לימין או שהיו מסוגלים לימין תוך ארבע שניות. זהו מדד נוסף לנקודת קצה הומנית והוקצה במדויק ב-97% מעכברי יילודים, בעוד ש-3% מהגורים הוקצו באופן שגוי כאמצעי לימין. להלן תוצאות מייצגות לשינוי משקל האחוזים של עכברים בהשוואה לזמן האתגר שלהם.
שינוי המשקל הממוצע בין ניצולים ללא ניצולים החל להיפרד ב 24 שעות לאחר האתגר, אבל יש הרבה חפיפה בין הקבוצות. היו כמה ניצולים שאיבדו מעל 20% משקל אבל עדיין התאוששו ממחלה. שינוי משקל לא היה יעיל כמו בחיזוי התוצאה בהשוואה להבדלים בתוצאות הבריאות ולכן הוא אינו משמש כקריטריון בקביעה אם עכברים נמצאים בנקודת קצה הומנית.
לסיכום, עכשיו אתה צריך להיות מסוגל להכין מלאי של תרחיף cecal קפוא, לחשב את המינון מותאם משקל. ולהזריק ולנטר עכברים שזה עתה נולדו לנקודות קצה אנושיות. אנו מקווים שזה יהיה משאב בעל ערך למחקר העכבר שלך.
