שבץ איסכמי הוא מצב קליני המאופיין hypoperfusion של רקמת המוח ותוצאות אובדן עצבי. עדויות רבות מצביעות על כך שהאינטראקציה בין גליה לתאי המשתנה מפעילה את השפעות הלחץ לאחר אירוע איסכמי. על מנת לחקור מנגנוני הגנה פוטנציאליים, חשוב לפתח מודלים המאפשרים ללמוד אינטראקציות נוירון-גליה בסביבה איסכמית.
כאן אנו מציגים גישה פשוטה לבודד אסטרוציטים ותאי עצב מקליפת המוח העוברית של חולדה, ועל ידי שימוש במדיום תרבותי ספציפי מאפשר הקמת תרבויות נוירון או אסטרוציטים מועשרים או תרבויות ניאו גליה עם תשואה גבוהה ושחזור. כדי לחקור את ההצלבה בין אסטרוציטים לנוירונים, אנו מציעים גישה, המבוססת על מערכת תרבת שותף, שבה נוירונים המתרבים בתגיות כיסוי נשמרים במגע עם מונוליאר של אסטרוציטים מצופים בצלחות מרובות בארות. שתי התרבויות נשמרות בחלקן על ידי ספירות פרפין קטנות.
גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית ויישום של טיפול ספציפי לכל סוג תא, המהווה יתרון במחקרים רבים. כדי לדמות את מה שקורה במהלך שבץ איסכמי, התרבויות כפופות לפרוטוקול מניעת חמצן וגלוקוז. פרוטוקול זה מייצג כלי שימושי לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון גליה בשבץ איסכמי.
התחל עם בידוד קליפת המוח העוברית של חולדה. העוברים הושגו ממשפחה של חולדות ב 15 ימים של הריון והם ממוקמים בצינור פלקון סטרילי המכיל PBS. עדיין בתוך עוברי שקית החלמון ממוקמים בתוך צלחת פטרי המכילה PBS קר.
בעזרת מספריים ופינצטה, שאק החלמון שבור, העובר מוסר ומונח בצלחת פטרי אחרת המכילה PBS קר מעל חבילת קרח. יש צורך להיות זהיר מאוד בעת שבירת שם החלמון לא לפגוע בעובר. מקם את העובר תחת מיקרוסקופ ניתוח, בעדינות לתקן את העובר באמצעות טוויזר.
החתך הראשוני צריך להיות מקביל לקליפת המוח. תיזהר לא לערוף את ראשו של החיה. הקרקפת מוסרים בזהירות לא לפגוע ברקמת המוח קליפת המוח.
החתך הבא מפריד בין קליפת המוח. הסר את כלי הדם הקיימים ברקמה. לבסוף, באמצעות פיפטה, להעביר את הרקמה קליפת המוח לצינור פלקון עם PBS.
ההשעיה של תא יחיד מתקבלת באמצעות עיכול מכני של רקמת המוח קליפת המוח באמצעות טיפים עם קוטר יורד. ודא כי הרקמה היא הומוגנית היטב לאחר העיכול, צנטריפוגה החומר ב 400 Gs במשך שלוש דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את המעים במדיום התרבותי, שהתחמם בעבר ל-37 מעלות.
לחשב את המספר הכולל של תאים נוכח ההשעיה באמצעות תא Neubauer ולה מכין את הדילול עבור צפיפות התא נאותה. לבסוף, לזרוע את התאים רב היטב דגירה ב 37 מעלות. על מנת להכין את החומר למערכת התרבות המשותף, מחממים את הפרפין בבלוק חימום עד שהוא הופך לנוזל.
לאחר מכן, בעזרת פיפטה פסטור זכוכית סטריאו להכין כדורים קטנים מעל תלושי הכיסוי שהוצבו בעבר רב באר, מצופה פולי D-לינזין. 24 שעות לפני שתי התרבויות מובאים במגע, לשנות את מדיום התרבות של נוירונים ואסטרוציטים כדי להשלים אותו NBM עם או בלי חום מושבת FBS. כאשר שתי התרבויות מוכנות לשימוש, להעביר את הנוירון, יושב בכיסוי מחליק עם כדורי פרפין ל בארות המכילות אסטרוציטים באמצעות פינצטה בעבר שקוע 70% אתנול.
לאחר הצבת שני סוגי התאים במגע, המתן 8 עד 12 שעות ולאחר מכן התחל את הגירויים וההליכים השונים. מחסור בחמצן וגלוקוז מבוצע בתרבות עם שבעה ימים של צמיחה. הסר את מדיום התרבות, ולשטוף את התאים פעמיים עם מדיום HBSS ללא תוספת גלוקוז.
ודא כי כל המדיום המכיל גלוקוז נשטף. לאטום את תא היפוקסיה ולהוסיף את תערובת הגז המכיל 95% חנקן ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע דקות עם זרימה של 20 ליטר במשך דקות כדי להחליף את החמצן הנוכחי בתוך התא. לאחר מכן, לעצור את הזרימה ולמקום את תא היפוקסיה באינקובטור ב 37 מעלות.
לאחר תקופת מחסור בחמצן וגלוקוז, החלף את המדיום, HBSS ללא תוספת גלוקוז עם מדיום התרבות המתאים להליכים הנותרים ותמהר את התאים ב -37 מעלות. על מנת לאפיין את סוג התרבות הקורטית, ביצענו אימונוהיסטוכימיה בשלושת הסוגים של תרבות קליפת המוח כדי להעריך את מספר התאים שהביעו GFPA או MAP2, שהם סמנים בשימוש נרחב עבור תאים אסטרוציטים ונוירונים בהתאמה. ניתוחים אלה גילו כי כאשר פרוטוקול זה, הצלחנו להשיג תרבות מועשרת טהורה של אסטרוציטים עם כ 97% מהתאים המבטאים GFAP.
לגבי התרבות המועשרת בנוירונים, אימתנו כ-78% מהתאים המבטאים MAP2. עם זאת אנו מזהים כ -18% של תאים שליליים GFAP ו- MAP2. עבור תרבות קליפת המוח נוירון גליה, זה נצפתה כי כ 49% מהתאים הם MAP2 חיובי.
31%הם חיוביים GFAP. ו-20%הם לא אחראים ל-GFAP ולא ל-MAP2. שבעה ימים לאחר הקמת התרבות הקורטית, תרבות הנוירונים-גליה והתרבות המועשרת בנוירונים היו נתונים להליך OGD במשך 4 ו -6 שעות.
לאחר הליך זה, התאים תויגו עם MAP2 ולאחר מכן מספר התאים החיוביים MAP2 כומתו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. בתרבות נוירון-גליה, זה נצפתה ירידה של כ 30% במספר הנוירונים, כאשר התרבות הוגשה לתקופה OGD של 4 שעות. לאחר תקופת OGD של 6 שעות, הארכת ההנעה עולה, להגיע על 60% של אובדן עצבי.
לגבי התרבות המועשרת של נוירונים שנחשפו OGD, זה נצפתה על 41%ו 64% ירידה במספר תאי MAP2. יתר על כן, נצפתה כי בתרבות המועשרת בנוירונים, חלה עלייה קלה בהרחבת הפציעה בהשוואה לתרבות הנוירונים-גליה שנחשפה גם ל- OGD במהלך 4 שעות. לסיכום, כאן מייצגים מודל במבחנה ללמוד שבץ איסכמי שהוקם בצורה פשוטה, מהירה ויקרה וניתנית לשחזור.
בנוסף, השיטה המתוארת מאפשרת גם ליישם נוירונים ותרבויות ראשוניות מועשרות אסטרוציטים, אך גם תרבות נוירונים-גליה. לכן, מתן מודל in-vitro גדול עבור מודל מספר מחלות מוח עם רמה גבוהה יותר של מורכבות, מאשר קווי תאים מונצחים תרבויות עצביות או גליה טהור.
