מדידת תגובת התרופה בזמן אמת בפרוסות רקמה אורגנוטימית לגידול

הפרוטוקול שלנו תואם לשיטות ניתוח מולקולריות אחרות ומאפשר הערכה של האופן שבו תרופות משפיעות על הכדאיות של פרוסות רקמה טקט וביצועים של סינון תפוקה בינונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים למדוד את הכדאיות של פרוסת רקמה שלמה בזמן אמת עם מעט מאוד לפני או לאחר עיבוד. טכניקה זו להאיץ פיתוח תרופה פרה קלינית ואונקולוגיה על ידי בדיקת מועמדים לתרופות או פרוסות רקמות שנרכשו ישירות מדגימות רקמת הגידול החולה.

שיטת הערכת הכדאיות של רקמות בזמן אמת היא די רב-תכליתית וונית ליישם אותן במחקרים בביולוגיה של סרטן, מדעי המוח וביולוגיה התפתחותית. הכנת פרוסות רקמה בת קיימא טקט הוא המפתח להצלחת ההליך. יש להתאים את הגדרות ה-Vibratome בהרכב בינוני בהתאם לסוג הרקמה ומוצקותה.

ביום רכישת פרוסת רקמת הגידול, aliquot 250 microliters של רקמות פרוסת תרבות בינוני לגם בצלחת 24 גם למקם אחד רקמה תרבות להוסיף לתוך כל באר. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני עד לשימוש. כדי לרכוש שברי רקמת הגידול, להטביע את רקמת הגידול בקרח קר HBSS בצלחת תרבות 10 ס"מ ולהשתמש אזמל לחתוך את הרקמה לשניים.

השתמש אגרוף ביופסיה שישה מילימטר לרכוש צילינדרים של רקמת הגידול לקצץ קצה אחד של כל גליל כדי ליצור משטח שטוח. מניחים את חתיכות הרקמה HBSS טרי, קר כקרח ולהדליק ויברטום. לחטא את כל הציוד עם שבעים אחוז אתנול ולהניח את מגש חיץ Vibratome, מכוסה מכסה זכוכית אקרילי, במרכז אמבט הקרח Vibratome.

מוסיפים קרח לאמבטיה, ממלאים את מגש החיץ ב-HBSS קר. לטעון סכין גילוח לתוך מחזיק הלהב ולהשתמש מדפים שיניים לבחור בקפידה דגימת גידול אגרוף ביופסיה. מוסיפים טיפה של דבק ציאנואקרילאט ברמה רפואית על צלחת הדגימה.

לטבול את הרקמה על פיסת מגבת נייר ללא מוך כדי להסיר כל חיץ עודף ולהוות את הצילינדר של רקמה על טיפה במצב יציב זקוף. לאחר שתיים עד שלוש דקות של ייבוש אוויר, מניחים את הצלחת במגש החיץ ומוסיפים HBSS נוסף למגש עד שהרקמות שקועות במלואן במאגר. לאחר מכן הרכיבו את הרטט על-ידי הנחת מגש הקרח ומכלול מגש החיץ על הרטט ונעילה של הזרוע.

הגדר את עובי חיתוך הרטט ל-250 מיקרומטר, את משרעת לשלושה מילימטרים, את מהירות החיתוך ל- 0.01 עד 0.25 מילימטרים לשנייה ואת זווית הלהב ל- 15 עד 21 מעלות. הגדר את מיקומי ההתחלה והסיום של הלהב והתאם את גובה הבמה. הפעל את המכשיר במצב רציף כדי לחתוך פרוסות במשך מספר מחזורים עד הרקמות נחתכים באופן אחיד.

השתמש בהעברת טיפים רחבה דו-קוטבית כדי להעביר את הפרוסות כמות קטנה של HBSS לתרבות תאים בודדים מוסיף בכל באר של צלחת 24 גם שהוכן בעבר ולהשתמש העברת קצה עדין דו-קוטבי כדי להסיר כל מאגר עודף מן הבארים. כאשר סוף המדגם כבר הגיע, להרכיב חתיכה חדשה של רקמה ולקבל פרוסות נוספות עד דגימות מספיק נרכשו. ואז לתרבת את הרקמות פרוסות באינקובטור תרבות התא במשך 24 עד 48 שעות.

כדי למדוד את הכדאיות של פרוסות הרקמה, להכין ריגרן מדידת הכדאיות מבוסס זוהר המכיל הן luciferase ו prosubstrate ב 1 עד 1 אלף דילול במדיום תרבות פרוסת רקמות טריות על פי הוראות היצרן ולהחליף את המדיום בכל באר של צלחת 24 גם עם התערובת. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובת מצעים של אנזימים על כל פרוסת רקמה ומנחים את הצלחת על שייקר מסלולי בתוך אינקובטור לח עם תסיסה עדינה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני בן לילה. למחרת בבוקר, למדוד את אות luminescence בכל באר על קורא מיקרופלסטיק באמצעות ההגדרות המתאימות.

לאחר קביעת הכדאיות הבסיסית של פרוסות הרקמה, להמיס את התרופות של עניין בתרבות פרוסת רקמות בינוני כדי להשיג פתרונות מלאי 10x ולהוסיף כל פתרון תרופה 10x למדיום התרבות בתחתית כל פרוסת רקמה היטב. מעבירים 50 מיקרוליטרים של התרופה בתוספת בינונית מתחתית כל באר על כל פרוסת רקמה ולהחזיר את הפרוסות שייקר מסלולית לילה. למחרת בבוקר, להעביר את צלחת התרבות אל חממת תת התרבות מבלי לרעוד ולמדוד את עוצמת זוהר בכל דגימת רקמה על קורא microplate בנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות.

לאחר מכן ניתן לחשב את הכדאיות של רקמות הגידול המטופלות בכל נקודת זמן באמצעות המשוואה כפי שצוין. הכדאיות של פרוסות הרקמה שהוכנו מדגם גידול סרטן השד העכבר יכול להישמר לפחות 21 ימים עם חילופי בינוני מדי פעם. הטיפול במעכב מולטיקינאז במשך ארבעה ימים מפחית את עוצמת אות האור פי 100 בהשוואה לשליטה ברקמות הגידול שטופלו בדימתיל סולפוקסיד.

טיפול עם מחצית הריכוז של אותו מעכב מקטין את luminescence כבר ביום הראשון ומגיע לרמה הנמוכה ביותר ביום הרביעי, נשאר נמוך עבור כל נקודת זמן נמדדת לאחר מכן. לעומת זאת, העוצמה המותנית של קבוצת רקמת הגידול המבוקרת נשארת יציבה לאורך כל תרבות ששת הימים. בנוסף, הטיפול בפרוסות גידול סרטן השד בעכבר עם מינונים סדרתיים של המעכב במשך ארבעה ימים ממחיש את השינויים תלויי המינון בכדאיות הפרוסה בריכוז היעיל החצי מקסימלי של התרופה.

קסנוגרפטים שמקורם בחולה שטופלו בטוקסורוביצין, תרופה כימותרפית סטנדרטית, מציגים גם שינויים תלויי מינון בכדאיות. כמו כן, הבדיקה של 17 תרופות פרה-קליניות ומאושרות קלינית ב- triplicate על פרוסות רקמות שהוכנו מ- xenograft יחיד שמקורו בתפזורת מספק הוכחת מושג כי הקרנת תרופות תפוקה בינונית יכולה להתבצע על פרוסות הגידול עם microenvironment הגידול המקומי. בעת הכנת דגימות רקמת הגידול, יש לדאוג למזער את המגע עם פרוסות הרקמה, כדי למנוע פגיעה ברקמה.

השיטה שלנו יכולה להיות יחד עם גישות אחרות כגון IHC, cytometry זרימה, או רצף תא יחיד, כדי לקבל מידע מרחבי תא יחיד מן הרקמות. הטכניקה שלנו מאפשרת בדיקה של ההשפעות של תרופות מרובות של עניין במינונים שונים בתנאים פיזיולוגיים לאורך זמן. בעת הכנת פרוסות רקמה מגידולים עם מצב פתוגן לא ידוע, הקפד לבצע את כל ההליכים ב ארון biosafety.