بروتوكولنا متوافق مع طرق التحليل الجزيئي الأخرى ويسمح بتقييم كيفية تأثير الأدوية على صلاحية شرائح الأنسجة في اللباقة وأداء فحص متوسط الإنتاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن قياس جدوى شريحة الأنسجة بأكملها في الوقت الحقيقي مع القليل جدا قبل أو بعد المعالجة. هذه التقنية تسريع التنمية قبل السريرية المخدرات والأورام عن طريق اختبار المرشحين المخدرات أو شرائح الأنسجة المكتسبة مباشرة من عينات أنسجة الورم المريض.
لدينا طريقة تقييم قابلية الحياة الأنسجة في الوقت الحقيقي هو تنوعا جدا ويمكن تطبيقها على بيولوجيا السرطان، وعلم الأعصاب، ودراسات البيولوجيا التنموية. إعداد شرائح الأنسجة القابلة للحياة في اللباقة هو مفتاح نجاح الإجراء. وينبغي ضبط إعدادات الاهتزاز في تكوين متوسط وفقا لنوع الأنسجة والحزم.
في يوم الحصول على شريحة أنسجة الورم، aliquot 250 ميكرولترات من الأنسجة شريحة ثقافة المتوسطة في بئر في لوحة 24 جيدا ووضع ثقافة الأنسجة واحد إدراج في كل بئر. ثم ضع الصفيحة في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون حتى الاستخدام. للحصول على شظايا أنسجة الورم، غمر أنسجة الورم في الجليد البارد HBSS في لوحة ثقافة 10 سنتيمترات واستخدام مشرط لقطع الأنسجة إلى النصف.
استخدام لكمة خزعة 6 ملليمتر للحصول على اسطوانات من أنسجة الورم وتقليم نهاية واحدة من كل اسطوانة لخلق سطح مستو. ضع قطع الأنسجة في ثلج طازج HBSS وتشغيل هزاز. تطهير جميع المعدات مع 70 في المئة الإيثانول ووضع علبة العازلة هزاز، مغطاة غطاء زجاجي الاكريليك، في وسط حمام الجليد هزازومي.
إضافة الجليد إلى الحمام، وملء علبة العازلة مع HBSS الباردة. قم بتحميل شفرة حلاقة في حامل الشفرة واستخدم ملقط مسننة لتحديد عينة ورم خزعة لكمية بعناية. إضافة قطرة من الصف الطبي سيانوكريلات الغراء على لوحة العينة.
داب الأنسجة على قطعة من منشفة ورقية خالية من الوبر لإزالة أي العازلة الزائدة وجبل اسطوانة من الأنسجة على قطرة في وضع مستقر تستقيم. بعد 2-3 دقائق من تجفيف الهواء، ضع اللوحة في علبة المخزن المؤقت وأضف HBSS إضافية إلى الدرج حتى يتم غمر الأنسجة بالكامل في المخزن المؤقت. ثم تجميع هزاز عن طريق وضع صينية الثلج وعوازل تجميع صينية على هزازوم وتأمين الذراع.
تعيين سمك القطع هزلي إلى 250 ميكرومتر، السعة إلى ثلاثة ملليمترات، وسرعة التقطيع إلى 0.01 إلى 0.25 ملليمتر في الثانية، وزاوية شفرة إلى 15 إلى 21 درجة. تعيين مواقع البداية والنهاية من النصل وضبط ارتفاع المرحلة. تشغيل الصك في وضع مستمر لقطع شرائح لعدة دورات حتى يتم قطع الأنسجة بشكل موحد.
استخدام نقل تلميح واسعة biped لنقل شرائح وكمية صغيرة من HBSS في كل خلية ثقافة إدراج في كل بئر من لوحة 24 جيدا أعدت سابقا واستخدام غرامة نقل تلميح biped لإزالة أي عازلة الزائدة من الآبار. عندما يتم الوصول إلى نهاية العينة، قم بتركيب قطعة جديدة من الأنسجة والحصول على شرائح إضافية حتى يتم الحصول على عينات كافية. ثم زراعة شرائح الأنسجة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 إلى 48 ساعة.
لقياس جدوى شرائح الأنسجة، وإعداد كاشف قياس قابلية البقاء على أساس الإنارة التي تحتوي على كل من لوسيفراز و prosubstrate في 1-100 dilution في شريحة الأنسجة الطازجة ثقافة المتوسطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واستبدال المتوسطة في كل بئر من 24 بئر مع الخليط. إضافة 50 ميكرولترات من خليط الركيزة الانزيم على كل شريحة الأنسجة ووضع لوحة على شاكر المدارية داخل حاضنة مرطبة مع التحريض لطيف في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، قياس إشارة الإنارة في كل بئر على قارئ microplate باستخدام الإعدادات المناسبة.
بعد تحديد الجدوى الأساسية لشرائح الأنسجة ، حل الأدوية ذات الاهتمام في الأنسجة شريحة الثقافة المتوسطة للحصول على حلول الأسهم 10x وإضافة كل حل المخدرات 10x إلى المتوسطة الثقافة في الجزء السفلي من كل شريحة الأنسجة بشكل جيد. نقل 50 ميكرولترات من المخدرات تكمل المتوسطة من الجزء السفلي من كل بئر على كل شريحة الأنسجة والعودة شرائح إلى شاكر المدارية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، نقل لوحة الثقافة إلى حاضنة الثقافة الفرعية دون اهتزاز وقياس كثافة الإنارة في كل عينة الأنسجة على قارئ microplate في النقاط الزمنية التجريبية المناسبة.
ويمكن بعد ذلك حساب صلاحية أنسجة الورم المعالجة في كل نقطة زمنية باستخدام المعادلة كما هو مبين. يمكن الحفاظ على صلاحية شرائح الأنسجة المعدة من عينة ورم سرطان الثدي الماوس لمدة 21 يومًا على الأقل مع تبادلات متوسطة عرضية. العلاج بمثبط multikinase لمدة أربعة أيام يقلل من شدة إشارة الإنارة بمقدار 100 مرة مقارنة بالسيطرة على أنسجة الورم المعالجة بكبريتيثوكسيد ثنائي الميثيل.
العلاج مع نصف تركيز المثبط نفسه يقلل من الإنارة في وقت مبكر من اليوم الأول وتصل إلى أدنى مستوى في اليوم الرابع، وتبقى منخفضة لكل نقطة زمنية محسوبة لاحقة. في المقابل، لا تزال كثافة الإنارة لمجموعة أنسجة الورم الخاضعة للرقابة مستقرة طوال فترة الذكرى الستة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن علاج شرائح ورم سرطان الثدي الماوس مع جرعات تسلسلية من المانع لمدة أربعة أيام يوضح التغيرات المعتمدة على الجرعة في قابلية الشريحة للحياة في التركيز الفعال للنصف الأقصى للدواء.
المريض المشتقة xenografts تعامل مع دوكسيوروبيسين, دواء العلاج الكيميائي القياسية, كما يحمل تغييرات تعتمد على الجرعة في القدرة على البقاء. علاوة على ذلك ، فإن اختبار سبعة عشر أدوية قبل السريرية والمعتمدة سريريًا في ثلاث نسخ على شرائح الأنسجة المعدة من xenograft مشتقة من المرضى بالجملة واحدة يوفر دليلًا على مفهوم أنه يمكن إجراء فحص متوسط للأدوية الإنتاجية على شرائح الورم مع البيئة الدقيقة للورم الأصلي. عند إعداد عينات أنسجة الورم، يجب الحرص على تقليل الاتصال بشرائح الأنسجة لتجنب إتلاف الأنسجة.
ويمكن أن يقترن أسلوبنا مع نهج أخرى مثل IHC، تدفق cytometry، أو تسلسل خلية واحدة، للحصول على المعلومات المكانية والخلايا المفردة من الأنسجة. يسمح أسلوبنا باختبار آثار الأدوية المتعددة ذات الاهتمام بجرعات مختلفة في ظل ظروف فسيولوجية مع مرور الوقت. عند إعداد شرائح الأنسجة من الأورام مع حالة الممرض غير معروف، تأكد من تنفيذ جميع الإجراءات في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
