עיצוב הסיליקון הנקבובי סרטים כמו נשאים של גורם הגדילה העצבי

NGF מועבר למוח הוא מאתגר. כאן אנו מציגים סוג חדש של נשא המאפשר שחרור בטוח וממושך של החלבון הביואקטיבי. טכניקה זו מאפשרת טעינה פשוטה ויעילה של NGF לתוך נושאות סיליקון נקבוביות.

זה מתבצע בטמפרטורת החדר וללא שימוש בממסים אורגניים חזקים. כמו עיצוב נושאת הסיליקון נקבובי הוא tunable המובילים יכולים לשמש שתלים מאגר NGF לשחרור לטווח ארוך, אבל יכול גם להיות שונה לשאת גורמים אחרים וסמים. עבור מהנדסים כימאים, תהליך הייצור עשוי להיות קל יותר לביצוע.

בעוד שעבור מדעני חיים וקלינאים, נהלי תרבות התא צריכים להיות פשוטים יחסית להתרבות. התחל על ידי הרכבה נקודה אחת חמש על נקודה אחת חמישה ס"מ רקיק סיליקון עם התנגדות מאופיינת היטב לתוך תא תחריט אתלין polytetrafluro באמצעות רצועה של רדיד אלומיניום כמגע אחורי o-טבעת לאטום את התא. הבד ניתן להחזרה לשימוש בוופלים מסיליקון עם ערכי התנגדות דומים בכל פעם.

אלקטרוכימיה לחרוט את דגימת הסיליקון בתסריט אחד עד שלוש של חומצה הידרופלואורית akleus ואתנול במשך 20 שניות בצפיפות זרם קבוע של 250 מיליאמפר לסנטימטר בריבוע. ואז לשטוף את פני השטח של סרט סיליקון נקבובי וכתוצאה מכך עם אתנול שלוש פעמים לפני ייבוש תחת זרם חנקן. כאשר המדגם יבש, מחמצנים תרמית את דגימת הסיליקון הנקבובית הטרייה בתנור הצינור בטמפרטורה של 800 מעלות צלזיוס למשך שעה באוויר הסביבה כדי ליצור פיגום סיליקון נקבובי מחומצן.

כאשר הדגימה התקררה, השתמש במסור dicing לחתוך אותו לדגימה שמונה על שמונה מילימטר. כדי לטעון את הדגימות עם NGF, לוותר על 52 microliters של פתרון טעינת NGF מוכן טרי על גבי כל מדגם הדגירה את הדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בצלחת מכוסה בתנאי לחות גבוהה. לאחר שעתיים, לאסוף את הפתרון על גבי הדגימות לדלל פתרון טעינת NGF ואת דגימות פתרון טעינת פוסט שנאספו לטווח הריכוז המתאים עבור ערכת iliza.

כאשר כל הדגימות כבר מדולל, להוסיף 100 microliters של דגימות מדוללות בדגימות עקומת כיול לכל באר של נוגדן לכידת NGF מצופה 96 צלחת איליזה היטב עבור דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת ארבע פעמים ולהוסיף מאה microliters של מיקרוגרם אחד למיליליטר של נוגדן גילוי biotentilated לכל באר עבור דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר ארבע שטיפות, כפי שהודגם להוסיף 100 microliters של Avidin-חזרת Peroxidace לכל באר עבור דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו ארבע שטיפות במאגר לשטוף כפי שהוכח.

לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פתרון מצעים לכל באר עבור דגירה לפיתוח צבע של 25 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש בקורא מיקרופלסטיק כדי למדוד את הספיגה ב 405 ננומטר עם תיקון אורך הגל מוגדר ב 650 ננומטר ולקבוע את ריכוז NGF הן בתמיסת הטעינה והן בתמיסת הטעינה שלאחר האיסוף המבוססת על עקומת הכיול. לשחרור In Vitro NGF, הדגירה NGF טעון נשאי סיליקון נקבובי מחומצן בשני מיליליטר של נקודת אפס אפס PBS טוחן אחד בתוספת אחוז אחד boyvine סרום אלבמן בנקודת אפס אפס שני אחוז נתרן אזיד ב 37 מעלות צלזיוס ו 100 סיבובים לדקה של תמוגה מסלולית.

לאסוף את הפתרון כל יומיים להחליף אותו עם שני מיליליטר של PBS טרי לאחר כל שאיפה. לאחר מכן להקפיא את דגימות שחרור שנאספו חנקן נוזלי עבור מינוס 20 מעלות צלזיוס אחסון עד ניתוח NGF על ידי איליזה כפי שהוכח רק. כדי ליצור סיטומה מובחנת feo cromo 12 או PC 12, תא תרבות, לאסוף את ההשעיה התא על ידי זפק מחדש להשעות את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום צמיחה בסיסי טרי.

לאחר זימון שני, להשעות את החיך בשלושה מיליליטר של מדיום צמיחה בסיסי ולהשתמש מזרק מד 23 כדי לשאוף את התאים 10 פעמים כדי להפריד את כל אשכולות התא. לאחר הספירה, זרע פעם אחת 10 לתאים הרביעיים אחוז ריבוע אזור עבודה על סוג קוליגן אחד מצופה צלחות בנוכחות מדיום ההידול. מניחים את הצלחות באינקובטור.

לאחר 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס להוסיף טרי מורין בטא NGF או NGF טעון נושא סיליקון נקבובי לכל צלחת ולהחזיר את הצלחות לאנקובטור. כדי להעריך את הכדאיות התאית, הדגירה את התרבויות עם 10 אחוזים של פתרון מחוון הכדאיות המתאים בנקודות זמן מייצגות במשך חמש שעות ב 37 מעלות צלזיוס ולמדוד את הספיגה על ספקטרופטומטר ב 490 ננומטר עם תיקון אורך הגל מוגדר ב 630 ננומטר. כדי להעריך PC 12 התא בידול בנוכחות נשאי סיליקון נקבובי טעון NGF, זרע את PC 12 תאים ב 12 צלחות מצופה קולגן נמוך במשך 24 שעות באינקובטור תרבות התא ולהציג את דגימות In Vitro שהושגו בעבר ל הבארות הניסיוניות המתאימות.

לאחר דגירה של 24 שעות, תדמיין את התאים לפי מיקרוסקופיה קלה וספירה ידנית של מספר התאים עם אלקרונוריטים בכל באר. לניתוח מורפומטרי של תאי PC 12 המובחנים, רכשו תמונות פאזה של התאים התרבותיים עד שלושה ימים לאחר הטיפול ב- NGF ופתיחת הקבצים בנוירון J.Convert את קובץ התמונה לפורמט של שמונה סיביות ולהשתמש בסולם התמונה כדי למדוד את יחס הפיקסל למיקרומטר. השתמש בניתוח והגדר קנה מידה כדי לקבוע את קנה המידה ולמדוד את האורך של כל נויריט.

לאחר מכן ספור ידנית את מספר נקודות הסתעפות ואת מספר ההוזנות שמקורן בכל סומה של תא. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה ברזולוציה גבוהה של הסרט סיליקון נקבובי מחומצן וכתוצאה מכך מוצגים. מיקרוגרף נוף עליון של הסרט חושף את אופיו הנקבובי מאוד עם נקבוביות בקוטר של כ -40 ננומטר.

מיקרוגרף חתך של סרט מחשוף חושף עובי שכבה נקבובי של שתי נקודות תשע מיקרומטר המאופיינת על ידי נקבוביות גליליות מחוברות. שחרור מתמשך של NGF ללא אפקט פרץ מושגת לתקופה של חודש אחד עם שחרור NGF מהיר יותר במהלך השבוע הראשון לעומת קצב שחרור איטי בהרבה בימים המאוחרים יותר של תקופת השחרור. טיפול עם נשאי סיליקון נקבובי טעון NGF גורם להיווצרות של neurites ברשתות עצביות מסועפות אופייניות תרבות תאים PC 12.

שים לב כי גם לאחר 26 ימים, NGF המשוחרר גורם להתבירות תאים של מעל 50 אחוזים המציין כי מלכודת NGF בתוך המארח הנקבובי משמר את הפעילות הביולוגית של החלבון לתקופה של כחודש. ניתוח מורפומטרי של NGF טעון סיליקון נקבובי מטופלים אוכלוסיות תאים בימים אחד ושלוש מגלה כי PC 12 תאים שטופלו NGF טעון סיליקון נקבובי להציג ערכים מורפומטריים דומים לאלה שנצפו בתרבויות הטיפול מבוקר עבור כל שלושת הפרמטרים שנבדקו. בעקבות ומספק כראוי את השלבים שהוצגו יספק לך מערכת משלוח NGF יתרון מסוגל לקיים את ההישרדות וההתברואה של תאים עצביים.

אנו חוקרים כעת את השימוש נשאי סיליקון נקבובי NGF כמו לטווח ארוך שחרור שתלים במוח כדי לחקור את אפקט ההגנה הרגיל שלהם לדעת מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר. בעקבות הליך זה, ההשפעה של נשאי סיליקון נקבובי טעון NGF על צמיחה נורמלית של תאי נמק עץ דוסל ניתן גם ללמוד. סיליקון נקבובי הוא חומר ננו מבטיח שניתן להשתמש בו עבור מגוון רחב של יישומים.

מלבד זה המוצג כאן, כולל חיישנים ביולוגיים או כימיים, אבחון והדמיה. כדי לשלול כל רעילות פוטנציאלית של נשאי הסיליקון הנקבוביים, לכיוון קו התא שלך, הקפד לבצע חיבור ניתוק ולעקר את דגימות הסיליקון הנקבוביות שלך.