פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לייצר סרטים לשגות זמן של Pseudomonas aeruginosa שורץ וללכוד את הדחייה של נחיל על ידי בקטריופאג 'או אנטיביוטיקה. הסרטים לשגות זמן ללכוד את הדינמיקה המפורטת של התגובה שורצת אנטיביוטיקה ו bacteriophage ואת הטכניקה רק דורש dehumidifier, מחשב, אינקובטור, וסורק מסמכים. כדי להכין צלחות אגר שורצות עבור P.aeruginosa שורץ זמן לשגות הדמיה, להשתמש פיפטה 25 מיליליטר להוסיף 20 מיליליטר של פתרון אגר נוהר לכל צלחת ניסיונית 10 ס"מ קוטר פטרי.
מניחים את הצלחות בערימה אחת עם מכסים במשך שעה בטמפרטורת החדר. הפעל את dehumidifier כדי להקטין את הלחות היחסית של החדר ל 40-50% כאשר אגר התגבש, לייבש את צלחות אגר שורץ במשך 30 דקות נוספות ברדס זרימה למינארית עם המכסים את הפנים כלפי מעלה ב 300 מטרים מעוקבים לדקה עם 40-50% לחות יחסית בטמפרטורת החדר. לאחר מכן אחסנו את צלחות הגר היובשות בארבע מעלות צלזיוס עד 24 שעות.
עבור ציפוי אגר נוהר, להחזיק קצה פיפטה P20 טעון עם חמישה microliters מתרבות P.aeruginosa לילה בזווית 10-45 מעלות 2-1/2 ס"מ מעל מרכז צלחת שורצת אחת ולדכא את הבוכנה כדי להפסיק הראשון לגעת אגר עם טיפה נוזלית בלבד. השתמש בתבנית כדי למקם את הנקודה באופן עקבי על-פני צלחות הגר השונות. כדי לצחצח זיהום פאג', תחילה לערבב 30 microliters של P.aeruginosa בתרבות לילה עם שישה microliters של אחד פעמים 10 כדי 12 לוח להרכיב יחידות למיליליטר של פאג DMS3 vir ומיד להוסיף שישה microliters של תערובת פאג P.aeruginosa בשש עמדות לווין שקילה על 2.8 סנטימטרים קונצנטריים
השתמש בתבנית כדי למקם את הנקודה באופן עקבי על פני צלחות אגר שונות. כדי צלחת טיפולים אנטיביוטיים, לערבב 30 microliters של P.aeruginosa בתרבות לילה עם הריכוז והנפח המתאים של אנטיביוטיקה של עניין ומיד להוסיף שישה microliters של חיידקים שטופלו באנטיביוטיקה בשש עמדות לווין שיווי משקל על מעגל רכזי רדיוס 2.8 ס"מ על מרכז המנה. השתמש בתבנית כדי למקם את הנקודה באופן עקבי על-פני צלחות הגר השונות.
כאשר כל התרבויות כבר מצופה, להחליף את מכסי צלחת פטרי ברור עם מכסים שחורים בהתאמה אישית. בזהירות למקם את צלחות אגר שורץ על סורק באינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס עם אמבט מים 10 ליטר כדי לשמור על הלחות ב 75% לאחר הצבת הצלחות לתוך הסורק, לפתוח את הקובץ ולשמור הגדרות כדי להגדיר את נתיב השמירה עבור התמונות ולחץ על סריקה וסדר במרווחים של 30 דקות. כדי להפוך את רכישת התמונה לאוטומטית, השתמש בתוכנת ה- Scripting.
בחר הן סריקה לא פעילה והן סריקה בודדת ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על סריקה לא פעילה ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על זמין. בסוף הדגירה, יבא את כל התמונות הסרוקות לתוך ImageJ. בחלון אפשרויות הרצף, מספר התמונות יציין את מספר התמונות שנבחרו.
המשך להפעיל את התמונה באחת כדי להתחיל מהתמונה הראשונה בתיקיה ואת תמונות קנה המידה ב- 100%כדי לשמר את הגודל המקורי של התמונות. לחצו על 'סמוי' ל-RGB כדי לשמור על צבע התמונות. השאירו את האפשרות 'השתמש בערימה וירטואלית' לא מסומנת ולחצו על הלחצן 'אשר' לטעינת התמונות.
לחץ על קובץ, שמור בשם ו- AVI כדי למזג את התמונות לקובץ AVI. התאימו את הדחיסה ל- JPEG ולקצב המסגרות לחמש מסגרות לשניה. לאחר מכן שמור את זמן האחסון של AVI לתיקיית האחסון המתאימה.
הדמיה לשגות זמן של מושבה אחת של P.aeruginosa מסוג פראי מצלחת אגר LB במרק LB לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו הבחין למרכז צלחת אגר שורצת מגלה צמיחה ראשונית בצורה של מושבה במרכז הצלחת המתפשטת בגידים באופן רדיני מהמושבה. נחילים נעים ממרכז צלחות הגר הנוהרים לפריפריה ונודפים על ידי אות לחץ הנפלט על ידי החיידקים שנדבקו בפאג'ים או טופלו בגנטמיצין. פאג'ים או ג'נטמיצין הבחינו לבד בעמדות הלוויין אינם גורמים לאוכלוסיות שורצות להימנע מאזורים אלה.
השתמש פיפטה 25 מיליליטר כדי להבטיח כי צלחות אגר שורץ מכילים בדיוק 20 מיליליטר. חשוב גם להתאים את זמן הייבוש של הצלחת בהתאם לסביבת המעבדה. הטכניקה שלנו מאפשרת לנו לדמיין את הדפוסים הנוהרים הכוללים של אוכלוסיות אווירוגינוזה פסאודומונס.
המטרה הבאה היא לפקח על תנועתיות תאים בודדת באמצעות מיקרוסקופיה של ברייטפילד.
