לימוד כיצד מיקרואורגניזמים לווסת את ההרכב הכימי של bilayers בודדים יודיעו הידע שלנו של מנגנונים של הרג אנטיביוטי, עמידות מיקרוביאלית ופתוגנזה המחלה. טכניקה זו מחיצות מעטפת התא של חיידקים גרם שלילי לשני שברים מוגדרים ללא שימוש בחומר ניקוי. לכן, שומנים, חלבונים וסוכרים ניתן להעריך בסביבה כי הוא יליד למחצה.
חלק מהצעדים תלויים בזמן ודורשים מיקוד וקואורדינציה. בתחילה, השתמש בדגמה אחת או שתיים. כאשר רמת הנוחות של אחד עולה, ניתן להוסיף דגימות נוספות.
לא יותר משש דגימות צריך להיות מטופל בבת אחת. זהו הליך רב-ימים ונקודות ביקורת חזותיות מועילות להערכת היעילות והשגיאה. לפני ביצוע שלבים לפעמים סופיים.
מפוספסים את החיידקים ממלאי גליצרול קפוא על צלחות אגר טריות. ברגע שהמושבות מתפתחות, מאחסנים את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס. השתמש במושבה אחת כדי לחסן צינור חמישה מיליליטר מלא במדיה מרק ותרבות החיידקים כרצונך בן לילה.
בחזרה לדלל את התרבות החיידקית לילה לתוך ליטר אחד של התקשורת מרק המועדף להידגר flasks. כאשר הצפיפות האופטית הרצויה הושגה, להסיר את flasks מהחממה ולה מניח אותם על קרח. למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר ולחשב את נפח התרבות המקבילה בין שש לשמונה פעמים 10 למושבה החיידקית האחת עשרה להרכיב יחידות.
הוסף נפח זה של תרבות לצינור צנטריפוגה ולהבטיח כי התרבויות הנותרות להישאר על הקרח עד שהם ישמשו. גלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ina זווית קבועה, צנטריפוגה במהירות גבוהה ב 7, 000 עד 10, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. בזהירות decant העל-טבעי ולהשליך אותו.
תוסיפו שוב כל גלולת תא ב-12.5 מיליליטר של חיץ A.Add פס ערבוב מגנטי לתליית התא. הוסף 180 מיקרוליטרים של 10 מיליגרם למיליליטר ליזוזיים לכל תא התדלדלות. לאחר איסוף חיידקים lysozyme EDTA מטופלים על ידי צנטריפוגה, להוסיף במהירות את מעכב פרוטאז, מגנזיום כלוריד ונוקלאז לחיידקים במהירות resuspend התאים במאגר B.Stir במשך שתי דקות, שמירה על המתלים על קרח.
לאחר מכן, להוסיף 12.5 מיליליטר של 1.5 מילימולר פתרון EDTA לכל תא המתלה מחדש ולהמשיך לבחוש על קרח במשך שבע דקות נוספות. Decant המתלים לתוך צינורות חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה המתלים ב 9, 000 עד 11, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את העל-טבעיים לתוך מיכל פסולת ביולוגית ושמור את הכדורים על הקרח. הוסף 25 מיליליטר של מאגר B לכל גלולת תא. לאחר מכן, הוסיפו 55 מיקרוליטרים של מגנזיום כלוריד אחד, מיקרוליטר אחד של רנז/dnase/nuclease reagent ומיקרוליטר אחד של קוקטייל מעכב פרוטאז.
תן מחדש את כדורי בתערובת. פיפטה ומערבולת נמרצות עד שהפתרונות נראים הומוגניים. אחסן את המתלים על קרח.
יוצקים את הדגימה לתוך גליל מדגם homogenizer ולהביא את התא ל 20, 000 PSI. כדי למנוע אירוסוליזציה של פתוגנים, תנאי המנגנון בלחץ במאגר B ולהתאים את רמות הלחץ לפני הוספת השעיה חיידקית. לעסוק בתא הלחץ ולהרומז 10 מיליליטר של חיץ B כאמצעי זהירות.
לאסוף את התא lysate ב 50 צינורות חרוט מיליליטר על קרח תוך שמירה על הדגימות על קרח. כדי להשיג תזה מלאה, חזור על תהליך זה שלוש עד חמש פעמים. כדי גלולה הנותרים, שלם, חומר התא, צנטריפוגה דגימות חיידקים lysed ב 6, 169 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
הפץ את supernatants אשר מכילים כעת את הממברנות הומוגנית, לתוך בקבוקי פוליקרבונט עבור אולטרה מרכז. Ultracentrifuge התא lysates ב 184, 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת. השליכו את העל-טבעיים ושמור את כדורי הממברנה על הקרח.
באמצעות, Dounce homogenizer, resuspend כדורי קרום במיליליטר אחד של פתרון שיפוע סוכרוז isopycnic בצפיפות נמוכה. לאחר מכן, השתמש בזכוכית, פיפט פסטר להעביר את הומוגנטי מדגם לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולה מניחים את הצינור על קרח. כדי להכין את שיפוע סוכרוז, החזק פוליפרופילן או צינור פתוח ברור במיוחד במצב מוטה מעט.
לאט להוסיף שני מיליליטר של פתרון סוכרוז בצפיפות גבוהה יותר. לאחר מכן להוסיף ארבעה מיליליטר של פתרון סוכרוז בצפיפות נמוכה יותר. בעת הכנת מעבר הצבע של הצפיפות, מוסיפים לאט את תסכול העצם כדי למנוע ערבוב של השכבות.
שכבות סוכרוז צריך להיות גלוי מעט להופיע בדרך כלל מוגדר. לאחר מכן, להוסיף את שבר הממברנה הכולל אשר היה בעבר resuspended במיליליטר אחד של צפיפות נמוכה, פתרון סוכרוז איזופיקני. לבסוף, למלא את שאר הצינור על ידי הוספת כ שישה מיליליטר של צפיפות נמוכה, פתרון שיפוע סוכרוז isopycnic.
Ultracentrifuge את הדגימות באמצעות רוטור דלי מתנדנד ב 288, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 16 עד 23 שעות. חותכים את הקצה את טיפ פיפטה P1000 על חמישה מיליליטר מהנקודה. לאחר השלמת הצנטריפוגה, השתמשו בפיפטה כדי להסיר את השכבה החומה העליונה מהצינור.
מעבירים שכבה זו, המכילה את שבר הממברנה הפנימי, לבקבוק פוליקרבונט לתנופה אולטרה-מרכזית. השאירו כשני מיליליטר של פתרון סוכרוז מעל הממשק בין 53%sucrose ו 73% סוכרוז כדי להבטיח כי החלק התחתון, לבן, הממברנה החיצונית לא לחצות לזהם את שבר הממברנה הפנימית. שוב באמצעות קצה פיפטה P1000 עם הקצה הוסר, להסיר את שכבת הממברנה החיצונית ולהעביר אותו לבקבוק פוליקרבונט.
ממלאים את החלל הנותר של בקבוק פוליקרבונט עם מאגר אחסון קרום מבודד ומערבבים על ידי היפוך או פיפטינג. שמור את הדגימות על קרח. כדי לאסוף את הממברנות, ultracentrifuge בקבוקי פוליקרבונט ב 184, 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לבסוף, השלך את העל-טבעיים והוסף 500 עד 1,000 מיקרוליטרים של מאגר אחסון. תן מחדש את הממברנות על ידי הומוגניזציה Dounce. לאסוף את הדגימות בשני צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר.
כדורי קרום סה"כ היו מגרדים, Dounce הומוגני ו ultracentrifuged מעל שיפוע צפיפות סוכרוז להפריד את הממברנות הפנימיות והחיוניות. שיפוע צפיפות סוכרוז של 20%53%73% הספיק לחלוקת זנים חיידקיים מסוימים. אך לא עבור חלוקה למחיצות של A.baumannii אשר מחולק בהצלחה באמצעות מעבר צבע של 20%45%73%..
כדי להעריך את יעילות ההפרדה, נבדקו דגימות קרום עבור NADH dehydrogenase, אנזים הממוקם בממברנה הפנימית החיידקית. ירידה בצפיפות האופטית ב-340 ננומטר הצביעה על נוכחות האנזים. צפיפות אופטית נמדדה עבור 50 דגימות מיקרוגרם של שברי קרום פנימיים וחיצוניים מסוג פראי S.typhimurium, E.coli K12 DH5a ו- galE מוטציה S.typhimurium.
ריכוז גבוה יותר של חלבון נוסף כאשר מסמן את הטוהר של שברי קרום A.baumannii כי בדיקה ראשונית באמצעות 50 מיקרוגרם הציע כי רמות יחסיות של NADH dehydrogenase היו נמוכים יותר עבור A.baumannii מאשר עבור זנים חיידקיים אחרים. כדי להעריך זיהום צולב של שברי הממברנה הפנימית עם שברי קרום חיצוני, LPS ו- LOS הוצאו והודמיו. התמציות הועמסו על ג'ל פוליאקרילמיד והוכתמו באזמרגד Pro-Q 300.
Acinetobacter baumannii הוא בראש סדר העדיפויות, עמידים לתרופות מרובות, פתוגן אנושי. פרוטוקול זה אמור לסייע לחוקרים להבין את התפקידים של lipooligosaccharides, פוספוליפידים וליפופרוטאינים במנגנוני ההתנגדות והארסיות של פתוגן ייחודי וחשוב זה. שיטה זו אידיאלית לניתוח במורד הזרם של פוספוליפידים, פחמימות גליקולפידים, חלבונים ומולקולות קטנות הקיימות בדרך כלל בתוך הממברנות הכפולות של חיידקים גראם שליליים.
