כאן אנו מדגימים כיצד להשתמש בחיישן FRET רגיש ATP ATeam 1.03 YEMK למדידות דינמיות של שינויים ברמות ATP עצביות ואסטרוציטיות בפרוסות היפוקמפוס עכבר מתורבתות אורגנוטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי אחד יכול ללמוד חילוף החומרים של האנרגיה ברקמת המוח חי בסביבה מבוקרת, סביבה עם רמות ביטוי חיישן גבוהות. טכניקה זו עשויה לסייע בהשגת תובנות על פתומכניזם, מחלות בסיסיות, או נזק מוחי, למשל, הנגרם על ידי מחסור באנרגיה, כמו שבץ איסכמי.
זה יכול, באופן עקרוני, לשמש לחקר רמות ATP, לא רק ברקמת המוח, אבל באיברים אחרים גם כן. כדי להפעיל בהצלחה את הניסוי הזה, חיוני לבצע את כל השלבים המעורבים culturing הרקמה זהיר מאוד ולשמור על סטריליות. יתר על כן, קצת ידע של הדמיה פלואורסצנטי הסלולר נדרש.
טיפול ברקמות בגישה המתוחכמת ביותר והדמיה חיוניים להבנת ההליכים הנכונים. הדבר נכון גם לגבי ניסויי הדמיה. הדגמת ההליך תהיה רודריגו לרצ'ונדי, פוסט-דוק, נה הואנג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה.
בצלחת פטרי קרה כקרח מלאה ב- ACSF, מניחים את המוח על קרום מסנן. להפריד את ההמיספרות ולבצע חתך parasagittal בזווית של 45 מעלות. תקן חצי כדור אחד בשלב רקמת הרטט עם דבק-על, והעבר מיד את בלוק הרקמה לאמבט הרטט המכיל ACSF קר כקרח עם 5% פחמן דו-חמצני ו-95% חמצן.
יישר את הרקמה באמבט הרטט. שמור על חצי הכדור השני ב- ACSF קר כקרח עד חיתוך. כוונן את הרטט לפרוסות חתוכים ב-250 עד 400 מיקרומטר.
לאחר חיתוך הפרוסה, זהה את היווצרות ההיפוקמפוס בהתבסס על המראה המורפולוגי הטיפוסי שלו ובודד אותו באמצעות מחטים מזרק, תוך שמירה על החלק של קליפת המוח הסמוכה להיפוקמפוס. מניחים את הפרוסה על רשת ב- ACSF, מחוממת ל-34 מעלות צלזיוס ומבעבעת ב-5% פחמן דו-חמצני ו-95% חמצן עד שכל הפרוסות נאספות. מעבירים את הפרוסות לארון הזרימה למינארי כדי להמשיך בתנאים סטריליים.
עם פיפטה פסטר הפוכה, סטרילית וזכוכית, מעבירים בעדינות את הפרוסות מה-ACSF לאחת ממנות פטרי מחוממות מראש, המלאות בתספורת סטרילית של הנקס. משנים את הפיפסה ומעבירים את הפרוסות לצלחת התרבות השנייה. חזור על התהליך חמש פעמים בסך הכל.
העבר כמה שפחות HBSS לצלחות התרבות הבאות. בעזרת פיפטה, מניחים בעדינות פרוסה אחת בכל פעם בחלק העליון של הוספת התרבות. הימנע מערבולות פיפטה, ולחכות עד הפרוסה יורדת לקצה פיפטה פסטר.
חזור על התהליך עבור כל פרוסה. מניחים שתי פרוסות על קרום. בזהירות להסיר כל פתרון האנק עודף מהחלק העליון של הכנס באמצעות טיפ עדין.
שמור את התרבויות באינקובטור לח ב 5%פחמן דו חמצני ו 37 מעלות צלזיוס עד יום הניסוי. החלף את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים. מבלי לגעת ברקמה, יש למרוח 0.5 מיקרוליטר של הווקטור המדולל ישירות על החלק העליון של כל פרוסה.
לבסוף, מניחים את הפרוסות בחזרה לתוך החממה ולשמור אותם שם לפחות שישה ימים נוספים. רגע לפני שמתחילים בניסוי, מעבירים הכנס המכיל פרוסות מתורבתות למכסה המנוע הסטרילי, ומכניסים אותו לצלחת של 30 מילימטר המכילה מיליליטר אחד של מדיום תרבות פרוסה אורגנותית, או מדיום חיוני מינימלי. מניחים את המנה מתחת לסטריאוסקופ ומתמקדים על פני השטח של הפרוסה.
השתמש בשתי מחטים מזרק סטרילי לעשות חתך לחצות קצר ממש על הקצוות הצרים של פרוסה שנבחרה, ובשכבה העליונה מבלי לפגוע ברקמה שמתחת. כדי להסיר את הפרוסה המוכנה מהתוספת, החזיקו את קצות הממברנה עם פינצטה ולהשתמש באזמל סטרילי כדי לבצע חתכים ישרים ומקבילים לקרום, ויוצרים ריבוע או משולש עם הפרוסה במרכז. אם ההוספה מארחת פרוסות נוספות, מעבירים אותה בחזרה לצלחת המקורית ולתוך החממה.
מתח פני השטח של המדיום ימנע את זליגתו אל פני השטח של הממברנה. הכן ACSF ניסיוני ולקבל pH של 7.4 על ידי מבעבע אותו עם 95%חמצן ו 5%פחמן דו חמצני דרך צינור מוכנס מחובר אספקת הפחמן לפחות שלושים דקות. שמור על בועות מלוחים במהלך הניסוי כולו.
לאחר מכן הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי של המונוכרומטר. מעבירים את תרבות הפרוסות האורגנוטיפיקות לתא הניסוי. מניחים רשת על גבי תרבות הפרוסות האורגנוטיפיקות כשהמסגרת למטה, לא נוגעים בתרבות, וחוטים למעלה, נוגעים בממברנה.
מניחים את התא על שלב המיקרוסקופ ולחבר אותו למערכת חיסון. הפעל את המשאבה ההיסטלית בקצב זרימה של 1.5 עד 2.5 מיליליטר לדקה. ודא שאין דליפה של מערכת חיסון.
באמצעות אור שידור, להביא את הפרוסה התרבותית לפוקוס ולזהות את האזור שבו ניסויים יבוצעו. לפני תחילת ניסויי הדמיה, המתן לפחות 15 דקות כדי לאפשר לפרוסות להסתגל לתנאי התמיסת מלח ולאחר מכן הפעל את המצלמה ואת תוכנת ההדמיה. רגש את חלבון הפלואורסצנט התורם ב 435 ננומטר.
הגדר את זמן החשיפה ל- 40 עד 90 אלפיות שניה. לאחר מכן הכנס את המראה הדיקורית ואת המסננים ליחידת מפצל הקרן. לפצל את פליטת הפלואורסצנטיות ב 500 ננומטר עם מפצל תמונת פליטה, ומעסיקים מסנני מעבר הלהקה ב 482 פלוס או מינוס 16 ו 542 פלוס או מינוס 13.5 ננומטר כדי לבודד עוד יותר את פלואורסצנטיות התורם והמקבל.
בחר אזור מעניין ככל הנראה נטול פלואורסצנטיות תאית עבור חיסור רקע. הקף בעיגול מבנים בודדים של רקמה מסומנת בתמונה על המסך כדי ליצור ROIs. הגדר את התדירות של רכישת תמונה ואת זמן ההקלטה הכולל.
לניסויים בני יותר מ-30 דקות, מומלץ לבצע תדירות רכישה של 0.2 עד 0.5 הרץ כדי למנוע פוטוטוקסיות. לאחר מכן, התחל את ההקלטה. כדי לגרום לשינויים ב- ATP תאי, העבר את צינור הזלוף מ- ACSF סטנדרטי לתמיסת מלח המכילה מעכבי מטבולית, למשל, פתרון אצמיה כימית.
לחלופין, השתמש מלוחים עם ריכוז אשלגן גבוה בשמונה מילימולרים כדי לחקות שחרור של יון אשלגן מתאי עצב פעילים. מיד לאחר ההקלטות, החלף את ה- ACSF הניסיוני ב- ACSF עם מאגר ערימות. ואז להעביר את תא ההקלטה המכיל את תרבות הפרוסה למיקרוסקופ סריקת לייזר confocal.
קח תמונות מחסנית Z ברזולוציית Z הגבוהה ביותר האפשרית בתצורה האופטית הנתינת. בפרוטוקול זה, עשרה ימים לאחר ההתמרה, נוירונים המבטאים ATeam 1.03 YEMK נמצאו בצפיפות גבוהה בניאוקורטקס של פרוסות רקמה מתורבתות בעומקים של עד 50 מיקרומטר מתחת לפני השטח הפרוסים. תוצאות דומות הושגו בהיפוקמפוס.
עבור אסטרוציטים, ATeam 1.03 YEMK בא לידי ביטוי תחת שליטתו של מקדם החלבון הפיברולרי האנושי, ופרוסות אורגנוטיפיקות המבטאת ATeam 1.03 YEMK בנוירונים ההיפוקמפוס שנבחרו ROIs מייצגים את סומטה של תאים פירמידליים. לאחר חשיפת הפרוסה ל-5 מילימולאר נתרן אזיד בהיעדר גלוקוז חוץ-תאי למשך דקה אחת, נגרמו שינויים מנוגדים בעוצמת הפליטה של זוג FRET. כמו כן נצפתה ירידה הפיכה ביחס ATeam FRET.
יחס ATeam FRET לטווח ארוך ב -14 תאים שונים בתנאים בסיסיים בנוירונים ובאסטרוציטים מראה כי ATeam הוא חיישן אמין ויציב. שים לב כי שום כימי הביא לירידה החזקה הצפויה ביחס ATeam בשני סוגי התאים בסוף ניסוי זה. עלייה בריכוז האשלגן החוץ-תאי משלוש עד שמונה מילימולרים במשך שלוש דקות לא גרם לשינוי ניכר בנוירונים המבטאת ATeam 1.03 YEMK.
לעומת זאת, אסטרוציטים הגיבו לעלייה באשלגן חוץ-תאי על ידי עלייה הפיכה ביחס ATeam FRET, מה שמצביע על עלייה ברמות ATP תאיות. שוב, שום כימי גרם לירידה מיידית ביחס ATeam, המוכיח כי החיישן יכול לזהות שינויים ATP. בעת ניסיון הדמיה סלולרית מבוססת FRET כמתואר כאן, חשוב לזכור כי הייצור של פרוסות באיכות גבוהה בתרבויות אורגנוטיפיק הוא צעד מפתח.
יתר על כן, הסרה זהירה של צלקת גליה והדמיה ברמת מומחה נדרשים. בעקבות הליך זה, אחד צריך גם להיות מסוגל לבצע ניסוי המשלב ננו-סנסור אחר מבוסס FRET אחר עבור מטבוליטים הסלולר. לדוגמה, אלה עבור גלוקוז או לקטט.
אחרון, אבל לא פחות, יש להדגיש כי מעשים רלוונטיים להגנה על בעלי חיים חייבים תמיד להיות שנצפו. זה נכון גם לגבי החוקים היעילים המסדירים את הטיפול באורגניזמים מהונדסים גנטית.
