We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

נהלי כל החיה היו בהתאם לחקיקה מקומית ואיחוד האירופי על ההגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוי (Directive 86/609 / EEC) ועם המלצות שהועלו על ידי הפדרציה של אגודות מדע בעלי חי מעבדה אירופאיות (FELASA). שניהם C57BL / 6 עכברים ועכברים FPR-RS3-i-ונוס שוכנו בקבוצות של שני המינים בטמפרטורת החדר על מחזור אור 12 שעות / כהה עם מזון כרצונך מים זמין. בניסויים צעירים (6-20 שבועות) של שני מינים היו בשימוש. אין הבדלים ברורים תלויה מגדרים נצפו. 1. פתרון כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן S 1 פתרון תאי: 4- (2-הידרוקסי-אתיל) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה (HEPES) שנאגר פתרון תאי המכיל (מ&quot;מ) 145 NaCl, KCl 5, 1 2 CaCl, 1 2 MgCl, 10 HEPES; pH = 7.3 (מנוכה עם NaOH); osmolarity = 300 mOsm (מנוכה עם גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן extracelluS 2 פתרון Lar: carbogen-מחומצן (95% O 2, 5% CO 2) פתרון תאיים המכילים (מ&quot;מ) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 2 CaCl, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7.3; osmolarity = 300 mOsm (מנוכה עם גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% פתרון agarose טמפרטורה נמוכה gelling (S 3) להטבעת רקמות: 4% agarose טמפרטורה נמוכה gelling. ממיסים 2 גרם נמוכה gelling agarose ב 50 מ&quot;ל של S 1 בבקבוק מעבדה זכוכית 100 מ&quot;ל יחד עם בוחש מגנטי. כדי להמס את agarose, הנחת את הבקבוק בתוך אמבט מים (עם מכסה לא סגור היטב) על 70 מעלות צלזיוס למשך כ 20 דקות או עד הפתרון הופך שקוף תוך ערבוב. להתקרר ולשמור agarose מומסת באמבט מים שני ב 42 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן S 4 פתרון התאי: פתרון פיפטה המכיל (מ&quot;מ) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0.3 CaCl 2 (Ca חינם 2 + = 110 ננומטר), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7.1 (מנוכה עם KOH); osmolarity = 290 mOsm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות / להתאים רכב S 1, S 2 ו- S 4 פי תכנון ניסוי בודד (למשל, חוסמים תרופתיים לבודד סוגים מסוימים של זרמים מופעלי מתח). </li></ol> 2. סביבת עבודה כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מחמצני תא אחסון פרוס עם S 2 לפחות 30 דקות לפני לנתיחה, במקום על קרח למשך התאמת טמפרטורה ו- pH פתרון oxygenate ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מאגר עבור הפרוסה superfusion על הקלטת התקנה עם S 2 ו חמצן ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לנתיחה, למלא vibratome קאמרית עם S 2 ולסדר קרח כתוש סביב החדר. לחלופין, להעביר פתרון מחומצן חילוף קרח קר מחמצנים קאמריים לתוך vibratome קאמרית ולשמור מחמצנים ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים כלים מתכלים כירורגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חבילת ג&#39;ל קרח מתחת לנתחמיקרוסקופ, מכסים במגבת נייר כדי למנוע רקמות VNO מן המקפיא אל החלק התחתון של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכין גילוח נקי על ידי שטיפה קצרה באתנול 70% ומים מזוקקים הר כדי vibratome. חלף עבור כל פגישת חיתוך. </li></ol> 3. VNO Dissection והטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב בעלי חיים על ידי חשיפה קצרה ל- CO 2 לערוף באמצעות מספרי כירורגיות חדים. הערה: ככל שזמן להקריב את החיה לשים את הקפסולה VNO על קרח הוא קריטי, למזער את הזמן פחות מ -2 דקות. כדי לשמור על כדאיות רקמות, להטביע הן VNOs מלא גזור agarose תוך פחות מ -30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלסת התחתונה עם מספרי כירורגיות גדולים. זן דרך חלל הפה ופצע את העצמות ושרירי לסת התחתונות של כל צד בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את החלק הנותר של הראש הפוך על צלחת פטרי הגדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כלפי חוץ את העור של הלסת העליונה וסביב קצה האף עם מלקחיים בינוניים כדי לקבל גישה טובה יותרחותכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי עצם לחתוך את החלק הגדול ביותר של החותכות בזווית ~ 45 ° בכיוון המקורי (איור 1 א). זה יקל הסרת הקפסולה VNO מחלל האף. הערה: אין לחתוך את שורש השן כדי למנוע נזק קצה הקפסולה VNO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את החיך העליון הנוקשה חלק המקורי שלה עם מלקחיים בינוניים ובזהירות לקלף בחזרה בחתיכה אחת בזווית שטוחה (איור 1 ב). הערה: שוב ושוב לשטוף עם S קר כקרח 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים באביב מיקרו לחתוך את היתוך הגרמי בין קצה העצם vomer והלסת. הכנס את הטיפים מספריים עם החלק המעוגל של קצה מצביע כלפי חוץ מן VNO בזהירות לחתוך את העצם בצעדים קטנים משני שמאל לרוחב בצד ימין הקפסולה VNO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הקפסולה VNO, להשתמש במספריים באביב מיקרו לחתוך את העצם vomer בחלק הזנב ובזהירות להרים את עצם vomer מתוך nASAL חלל באמצעות מלקחיים בינוניים. מיד להעביר את VNO אל צלחת פטרי קטנה תחת מיקרוסקופ סטריאו על חבילת ג&#39;ל הקרח שבו השלבים הנותרים של הניתוח יבוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את VNO כמות קטנה של קר כקרח S 2 כדי למנוע את רקמות מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את כמוסות סחוסים המכילות רקמות הרכות VNO ידי גרירה האחורית של עצם vomer עם מלקחיים בינוניים. מקם את הקפסולה עבור תצוגה הגבי כך פיצול בין שני VNOs הופך לגלוי (איור 1D i). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה מלקחיים בסדר להפריד הסחוס הוא כמוסות VNO מהעצם המרכזית, תוך שמירה על עצם vomer מרותק בחלק האחורי. הערה: שימוש במלקחיים רק בשולי הקפסולה הסחוס להיזהר מאוד שלא לחדור מבעד הסחוס כמו האפיתל החישה העדין נפגע בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שני VNOs מופרדים, להתחיל להסיר את הסחוס encapsulating האשוחיםt VNO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את השולים העליונים של קפסולה עם אחד מלקחיים בסדר התפצל קיר הסחוס שצורף בעבר עד עצם vomer (בצד המדיאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר הנותרים סחוס להפוך את VNO עם צד לרוחב המעוגל שלה לתחתית המנה ובבטחה להצמיד הסחוס בצד אחד באמצעות מלקחיים. בזהירות להזיז את מלקחיים בסדר השני מהצד האחורי בזווית מאוד שטוח בין סחוס VNO לרופף את הקשר בין רקמות הסחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לקלף את VNO מן הסחוס על ידי מחזיק אותו קצה הזנב שלה, כדי למנוע ניזק האפיתל החושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר VNO היא דחסה הקפסולה, הקפד להסיר את כל חלקי הסחוס הקטנים הנותרים כמו כל חלקים נותרים של סחוס תנתק את הרקמה שמסביב agarose במהלך תהליך החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה קטנה של קר כקרח S 2 על VNO גזור הראשון כדי למנוע נזק לרקמות. כלי דם גדולים על wil צד לרוחבl להיות גלוי המציין כי האיבר עדיין לא נפגע ולא נפגע גס במהלך הניתוח (איור 2 א ii). במקרה כלי דם ניזוק, הוא עדיין יהיה כדאי להמשיך עם חותך את VNO עוד המורפולוגיה הכוללת לא נפגמה בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לנתח את VNO השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להטביע את VNOs, למלא שתי צלחות פטרי הקטנות אל שולי עם מומסת S 3 (מאוחסן באמבט מים ב 42 ° C; ראה 1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את VNO על קצה זנב הרחב עם מלקחיים בסדר, כדי למנוע פגיעת האפיתל החושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את VNO ב agarose והעבר אותו אופקי הלוך ושוב כמה פעמים כדי להסיר את הסרט של פתרון תאי וכן כל בועות אוויר מפני השטח שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את VNO אנכית עם קצה הזנב מול התחתון של המנה. במקום צובט את VNO עם המלקחיים ישירות, לשנות את הכיוון על ידי הזזת קצה מלקחי proximi הקרובty אל VNO. הערה: האורינטציה במהלך ההטבעה היא קריטית שכן היא קובעת מטוס פרוס ונגישות עצב סנסורי במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מנות על חבילת ג&#39;ל הקרח ולהמתין עד agarose יש הקרושה. הערה: אין לשנות את הנטייה VNO לאחר agarose החלה לחיזוק כמו זה יהיה לנתק את הרקמה מן agarose שמסביב. </li></ol> 4. רקמות VNO עטרה פרוסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מרית קטנה כדי להסיר גוש agarose מצלחת קטנה לתוך המכסה של צלחת פטרי גדולה, להעיף את agarose במהופך השארת טיפ הזנב של VNO כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הגוש לתוך צורת פירמידה באמצעות אזמל כירורגי (3-4 מ&quot;מ בקצה, 8-10 מ&quot;מ בתחתית). יש להיזהר שלא לגרום נזק לרקמות מוטבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בדבק סופר לתקן את בלוק בצורת פירמידה למרכז הצלחת הדגימה vibratome ולחכות ~ 1 דק &#39;על הדבק להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את צלחת דגימת ג החיתוךhamber ולהכין את VNO השני, בהתאם. שמור צלחת עם הדגימה השנייה ב 4 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש microtome להב רוטט עם ההגדרות הבאות: עובי: 150-200 מיקרומטר; מהירות: 3.5 au = 0.15 מ&quot;מ / sec; תדירות: 7.5 au = 75 הרץ. עבר פרוסות לתא מחמצנים עד לשימוש לאחר שבדק פרוסת מורפולוגיה לזמן קצר תחת מיקרוסקופ לנתח. פרוסות יכולות להישמר במשך כמה שעות. </li></ol> 5. הקלטות אלקטרו מתא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הקלטות, משתמש במיקרוסקופ קבועה בשלב זקוף מצוידות מטרות טבילה במים, Dodt או בניגוד הפריע הפרש אינפרא אדום (IR-DIC), ואת קרינת EPI וכן CCD-מצלמה מקוררת. עבור רכישת נתונים, השתמש מגבר תיקון- clamp, לשלב את הראש, AD / לוח הממשק DA לבין מחשב (כולל תוכנת צריבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מלאי של 10-20 טפטפות תיקון (4-7 MΩ). טפטפות משוך מן נימי זכוכית בורוסיליקט (1.50 מ&quot;מ OD / 0.86 מזהה מ&quot;מ) usinחולץ micropipette ga ו-פולנית אש עם microforge. הערה: אש ליטוש הטיפים פיפטה הוא חיוני כאשר תיקום VSNs קטן למדי. זה יעזור למנוע פקיעת קרום התא בעת הפעלת לחץ שלילי על מנת לקבל חותמת עמידות גבוהה. לאחר ליטוש פתיחת פיפטה צריך להיות כ 1 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור טפטפות בצנצנת אחסון פיפטה כדי למנוע נזק הצטברות אבק עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מערכת זלוף ידי מילוי מאגרי פתרון צינורות פי תכנון ניסוי. הערה: הסר בועות אוויר וצינורית לחלוטין כפי שהם יפריעו הקלטות אלקטרו בחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם הלחץ להשיג ~ 3 מ&quot;ל / זרימת דקות. הערה: בלחצים גבוהים יגרמו לתנועה של פרוסת רקמות וכן סיום הקלטות אלקטרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר VNO פרוסה תא הדמיה ולתקן את העמדה פרוסה באמצעות עוגן נירוסטה חוטית עם 0.1 מ&quot;מ עובי syntסיבי hetic (התרשים 2B - C). הערה: אין לכסות את פרוסת רקמה עם אחד הנושאים סיבים סינתטיים אלא agarose סביב פרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לחדר ההדמיה כדי הקלטה להתקנה פרוסה Superfuse ברציפות עם S מחומצן 2 בטמפרטורת החדר באמצעות יישום אמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את נימי היניקה אל פני השטח של הפתרון ליצור יניקה איטית חליפין קבועים של פתרון אמבטיה. התאם את &quot;עיפרון זלוף&quot; 8-in-1 רב חבית מעל וקרוב החלק הלא-חושית של הפרוסה VNO המכיל את כלי הדם (איור 2 ג, 3 ​​א) 50. זה יהיה מועיל לארגן עיפרון זלוף פיפטה ההקלטה להיות מול הפרוסה מכיוונים מנוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אלקטרודה השוואתית ופתרון אמבטיה באמצעות גשר אגר בצורת L (מלא 150 KCl מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו פיפטה תיקון עם פיפטה פתרון S 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר פיפטה על האלקטרודה תיקון כסף מצופה כלוריד מחוברת אל במת הראש ללא מקרצף את הציפוי ולצרף בתקיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ חיובי קלה (כ 1 מ&quot;ל על מזרק פלסטיק 10 מ&quot;ל) ל פיפטה את התיקון לפני הכניסה לאמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את פיפטה לתוך האמבט באמצעות מניפולטורים מיקרו רחוק מספיק כדי להיות מסוגל להטביע את המטרה מבלי להכות אותו (2D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התנגדות פיפטה (PIP R, בין 4-7 MΩ) באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה מחובר לשלב את הראש. הערה: אם R פיפ &lt;4 MΩ קצה זכוכית שבורה. אם R פיפ&gt; 10 MΩ, קצה יש סתימה ככל הנראה ואת פיפטה חייב להיות מוחלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את פרוסת VNO עם המצלמה CCD באמצעות התערבות ההפרש לעומת אינפרא אדום אופטימיזציה (DIC) ולזהות תאים FPR-RS3-i-ונוס לבטא (או נוירונים שכותרתו דומה) באמצעות תאורה פלואורסצנטיו קוביית מסנן מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס פלורסנט היעד או תאים שאינם פלורסנט בהתאם לעיצוב ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתקרב גוף התא, השתמש גלגלי יד רגישות מקסימלית. בשל לחץ חיובי, שקע קטן בקרום סומה תא הופך לגלוי פעם קצה פיפטה נמצא בסמיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר לחץ חיובי להפעיל לחץ שלילי קל למצוץ בקרום התא על מנת להשיג חותם עמידות גבוהה (1-20 GΩ). החל יניקה קצרה ועדינה לשבש את קרום התא ולבסס את תצורת כל התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התנגדות גישה ללא הרף במהלך הניסוי. הערה: רק כולל נוירונים מפגינים התנגדות גישה קטנה ויציבה (≤3% של מכניסה; שינוי &lt;20% במהלך הניסוי) לתוך ניתוח. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

VNO הוא מבנה chemosensory מאתר semiochemicals. נכון להיום, רוב הקולטנים vomeronasal נותר deorphanized כזוגות קולטן ליגנד רק כמה זוהו. בין אלה, V1rb2 תואר להיות מופעל על-ידי יצרן פרומון 2-heptanone שתן זכר 30, V2rp5 להיות מופעל על ידי ESP1 פרומון ספציפי זכר 57 וכן V2r1b ו V2rf2 כדי להיות מופעלים על ידי פפ?...

רוב בעלי החיים להסתמך בכבדות על החושים הכימיים שלהם לתקשר עם סביבתם. חוש הריח ממלא תפקיד חיוני למציאת והערכת מזון, הימנעות טורפים ואיתור שותפים ההזדווגות מתאים. ברוב היונקים, מערכת חוש הריח מורכב מלפחות ארבעה תת היקפי אנטומית והן מבחינה תפקודית ברורים: אפיתל ההרחה הראשי 1,2, גנגליון Grueneberg 3,4, האיבר במחיצה של Masera 5,6 ואת איבר יעקובסון. VNO כוללת המבנה החושי ההיקפי של מערכת חוש ריח האבזר (AOS), אשר ממלאת תפקיד מרכזי באיתור לאותות כימיים המעבירים מידע על זהות, מגדר, מעמד חברתי ומדינה מינית 7-10. VNO ממוקם בבסיס של מחיצת האף ממש מעל החיך. בעכברים, זה הוא צינור דו צדדי שהסתיים סמיות מגודר בתוך הקפסולה סחוסי 11-13. האורגן מורכב הן של epithe חושית המדיאלי בצורת חצי סהרlium כי מטפח את VSNs ושל חלק הלא-חושי בצד לרוחב. בין שניהם epithelia טמון לומן מלא ריר אשר מחובר אל חלל האף דרך הצינור הצר vomeronasal 14. כלי דם לרוחב גדולים בתוך הרקמה הלא-החושית מספקים מנגנון שאיבת כלי דם כדי להקל על כניסה של גדולות יחסית, בעיקר מולקולות בלתי נדיף כגון פפטידים או חלבונים קטנים לתוך לומן VNO באמצעות לחץ שלילי 15,16. הרכיבים המבניים של VNO נוכחים בלידה והאיבר מגיע לגודלו זמן קצר לפני גיל ההתבגרות 17. עם זאת, אם AOS מכרסם כבר תפקודי קטינים עדיין נושא לויכוח 18-20. VSNs מאופיין הוא מיקומם אפיתל את סוג הקולט שהם מבטאים. VSNs להראות מורפולוגיה דו קוטבית עם אקסון מחוסר מיאלין לבין דנדריט פסגה יחיד שבולט כלפי הלום ומסתיים ידית הדנדריטים microvillous. גרזן VSNons fasciculate ליצור את עצב vomeronasal שמשאיר הקפסולה סחוסי בסוף dorso-הזנב, עולה לאורך מחצה, מעביר את הצלחת cribriform ופרויקטים הנורה חוש הריח אביזר (AOB) 21,22. האפיתל חושית vomeronasal מורכב משתי שכבות: השכבה הפסגה ממוקם קרוב יותר אל הצד luminal ונמלים הן V1R- וכל אבל סוג אחד של FPR-rs-להביע עצב. נוירונים אלה coexpress G-חלבון α-למקטע G αi2 ופרויקט לחלק הקדמי של AOB 23-25. עצב סנסורי ממוקם V2Rs המפורש שכבת בסיס יותר או FPR-rs1 לצד αo G ולשלוח האקסונים שלהם לאזור האחורי של AOB 26-28. נוירונים vomeronasal מופעלים ככל הנראה על ידי semiochemicals קטן למדי 29-33 (V1Rs) או תרכובות חלבוניים 34-38 (V2Rs) כי מופרשים לתוך נוזלים שונים בגוף כגון שתן, רוק ולקרוע נוזל 37,39-41 </sup&gt;. בניסויים באתרו הראו כי VSNs גם מופעלים על ידי פפטידים formylated שונים תרכובות מיקרוביאלית / צמודי דלקת 25,42. יתר על כן, heterologously הביע חלבונים-rs FPR לשתף ספקטרום אגוניסט עם FPRs לידי ביטוי את המערכת החיסונית, מה שמעיד על תפקיד פוטנציאלי גלאי עבור מחל conspecifics או מקורות מזון מקולקלים 25 (ראה אסמכתא 43). יסוד להבנת יחסים ליגנד רצפטור ומפלה איתות במורד באוכלוסיות ספציפיות VSN הוא הערכה מפורטת של מאפייני biophysical הבסיסיים שלהם בסביבת ילידים. בעבר, ניתוח של איתות הסלולר יש יתרון מאוד מבעלי חיים מהונדסים גנטית המציינים אוכלוסיה מוגדרת של נוירונים ידי coexpressing חלבון בסמן פלורסנטי 30,44-49. בפרוטוקול זה, קו עכבר מהונדס המבטא FPR-RS3 יחד עם סמן פלואורסצנטי (FPR-RS3-i-ונוס) משמש.גישה זו מדגימה איך להעסיק כזה זן עכבר מהונדס גנטי כדי לבצע ניתוח אלקטרו של אוכלוסיית תאים לזיהוי אופטי באמצעות הקלטות תיקון- clamp נוירון הבודד בחתכי רקמת VNO עטרה חריפים. לחץ מונחה אוויר מערכת זלוף רב-קניים עבור גירויים חושיים וסוכנים תרופתיים מאפשר מהיר, הפיך מוקדי גירוי עצבי או עיכוב במהלך הקלטות. הקלטות כל תא בהכנות פרוסות לאפשר ניתוח מפורט של תכונות מהותיות, conductances מופעל במתח, כמו גם דפוסי פריקת פוטנציאל פעולה בסביבה המקורית של התא.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose (low-gelling temperature)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical tools and consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large Petri dish, 90 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>decapitation, dissection of VNO capsule</td></tr><tr><td>Small Petri dish, 35 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose</td></tr><tr><td>Sharp large surgical scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>decapitation, removal of lower jaw</td></tr><tr><td>Strong bone scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>cutting incisors</td></tr><tr><td>Medium forceps, Dumont tweezers #2</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>removing skin and palate</td></tr><tr><td>Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>cutting out VNO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>dissecting VNO out of cartilaginous capsule</td></tr><tr><td>Small stainless steel spatula</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>handling agarose block and tissue slices</td></tr><tr><td>Surgical scalpel</td><td></td><td></td><td>cutting agarose block into pyramidal shape</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)</td><td>Science Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence lamp</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate magnetic stirrer</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator Device&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller, vertical two-step</td><td>Narishige</td><td>PC-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer&amp;nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system 8-in-1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH Meter five easy</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette storage jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>Recording chamber&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>Slice mini chamber</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments)</td><td>custom-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Trigger interface&amp;nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Water bath&amp;nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

in-depth physiological analysis of defined cell populations in acute tissue slices of the mouse vomeronasal organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

כדי לקבל תובנות לגבי מאפייני biophysical ופיזיולוגיים של אוכלוסיות תאים מוגדר, אנו מבצעים בחתכי רקמה העטרה חריפה של העכבר VNO (איור 1 - 2). לאחר דיסקציה, פרוסות יכולות להישמר פתרון תאי מחומצן קר כקרח (S 2) במשך כמה שעות. בשעה הגדרת הקלטה,...

Watch this Scientific Journal Video about In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ at JoVE.com

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

in-depth-physiological-analysis-defined-cell-populations-acute-tissue

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.6K Views.  RWTH Aachen University. Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings. 

Video: In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

מערך Multielectrode הקלטות של האפיתל Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures. The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, respiratory, and squamous epithelia which differ markedly in anatomical locations, morphology, and functions. In adult mice, the nose is covered with various skull bones, limiting experimental access to internal structures, especially those in the posterior such as the main olfactory epithelium (MOE). Here we describe an effective method for obtaining almost the entire and intact nasal tissues with preserved anatomical organization. Using surgical tools under a dissecting microscope, we sequentially remove the skull bones surrounding the nasal tissue. This procedure can be performed on both paraformaldehyde-fixed and freshly dissected, skinned mouse heads. The entire deboning procedure takes about 20-30 min, which is significantly shorter than the experimental time required for conventional chemical-based decalcification. In addition, we present an easy method to remove air bubbles trapped between turbinates, which is critical for obtaining intact thin horizontal or coronal or sagittal sections from the nasal tissue preparation. Nasal tissue prepared using our method can be used for whole mount observation of the entire epithelia, as well as morphological, immunocytochemical, RNA in situ hybridization, and physiological studies, especially in studies where region-specific examination and comparison are of interest.

שיטה ידנית פירוק עצמות אפקטיבית להכין רקמות האף מאוס שלמות עם ארגון האנטומי משומר

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Biology

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from Vomeronasal Sensory Neurons

Source: Ackels, T., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54517">In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The protocol video describes establishing a whole-cell patch clamp for electrophysiological recording from the sensory neurons of the vomeronasal organ (VNO) in mice. A coronal VNO slice with fluorescently labeled sensory neurons is placed in a recording setup. A labeled neuron is patched with a recording pipette in a whole-cell configuration for electrophysiological recording in response to chemical stimuli.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירונים חושיים Vomeronasal

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Solution Preparation

	Prepare ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Preparation of Mouse Vomeronasal Organ for Vibratome Sectioning

Source: Ackels, T., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54517">In-depth physiological analysis of defined cell populations in acute tissue slices of the mouse vomeronasal organ.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video outlines the isolation of a mouse vomeronasal organ (VNO) and tissue preparation for vibratome sectioning. Sections are used to characterize the biophysical and physiological attributes of a specific group of sensory neurons.

הכנת איבר Vomeronasal עכבר עבור חתך Vibratome

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
Both ...

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Perforated Patch-Clamp Recording of Olfactory Sensory Neurons in Mice

For this protocol, have mice available between 2 and 4 weeks old. In this presentation, mice expressing OR/IRES/tauGFP are used.
By using OR/IRES/tauGFP mice, all neurons expressing the OR of interest will be labeled with GFP. This method can be used for OR expressed in all zones. However, dissections and recordings will be easier for OR expressed in the dorsal zone.
Begin by anesthetizing and then decapitating a mouse.
The outcome of this protocol depends on the quality of the dissection. These dissection steps must be as short as possible and be precise.
To begin the surgery, use dissecting scissors to make a longitudinal cut along the dorsum. Pull skin apart to remove it. Then, cut along the lower jaw and make a coronal cut parallel to the teeth. Thus, remove the upper incisor teeth. Now, make a coronal cut around the head, behind the eyes. Discard the posterior head, and transfer the anterior portion to ice-cold Ringer&#39;s.
Now, under a dissection microscope, isolate the septum within 5 to 10 minutes. Start with a longitudinal cut along the ventral side. Then, cut the dorsal bones longitudinally along the dorsal lateral side of the nasal cavity.
Next, remove most of the bones and the palate. Transfer the isolated septum and attached epithelium to a container of oxygenated Ringer&#39;s at room temperature. Within five minutes, make the final preparations before recording.
The solution must not be too warm, or the preparation will look damaged. To access the neuroepithelium for recording, first, peel the epithelium from the underlying septum with forceps. Then, using micro-Vannas scissors, cut the anterior end of the septum to release the epithelium.
Now, carefully remove the vomeronasal organ. Cut it off where it is attached dorsally. The isolated epithelium can now be moved to the recording chamber, mucus side up. Once in place, use a harp to flatten the tissue. Then, transfer the chamber to an upright microscope. Visualize the neuroepithelium under a 40x water immersion objective while perfusing it continually with fresh Ringer&#39;s at room temperature.
To begin, search for the cells of interest, which, in this case, express EGFP. So 480-nanometers light is used to scan for cells that emit light in the 530 to 550-nanometer range. The targeted dendritic knobs and OSNs, when reviewed at 80 to 160x under bright field, should be clearly distinguishable from the supporting cells.
Now, load the electrode with the nystatin solution. Tap out any bubbles that form, and attach the electrode to the holder. Now, apply some positive pressure. The expected resistance is between 15 and 20 megaohms. Then, bring the electrode to the cell while maintaining the positive pressure.
When the resistance increases to about 40 megaohms, release the pressure and apply a slight negative pressure. If a gigaseal is made, the membrane potential should be clamped at about negative 75 millivolts.
Now that the cell is open, proceed with the experiment. Apply stimulation protocols and perfuse with pharmacological treatments as needed. To test with a single odorant, record 200 to 500 milliseconds of spontaneous activity. Apply the odorant for 500 milliseconds, and then, measure responses for up to 10 seconds.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מערך Multielectrode הקלטות של האפיתל Vomeronasal

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

שיטה ידנית פירוק עצמות אפקטיבית להכין רקמות האף מאוס שלמות עם ארגון האנטומי משומר

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירונים חושיים Vomeronasal

הכנת איבר Vomeronasal עכבר עבור חתך Vibratome

רישום טלאי מהדק מחורר של נוירונים חושי ריח בעכברים