טכניקה נפוצה כדי לגלות את הפונקציה של חלבון היא למחוק אותו ולראות מה קורה. אבל אתה לא יכול לעשות את זה עם חלבון חיוני. זה חיוני, התא מת.
אז אתה צריך דרך להסיר את החלבון הזה ולהצצה למה שקורה ממש לפני מות התא. דלדול חלבונים צריך להיות מהיר, כך שאתה לא מקבל שום השפעות משניות. זה צריך להיות ספציפי, כך שרק חלבון זה מוסר ורק מדולדל כאשר אתה רוצה שזה יהיה.
וזה לא אמור להשפיע על התא בשום דרך אחרת מלבד הסרת החלבון הזה. לאחר הכנת המתח, השתמש בתרבות לילה כדי לקבוע מה דילול יש צורך. השתמש במידע זה כדי להגדיר תרבות חדשה מספיק עם OD600 בין 0.1 ו 0.2, ולהגדיל אותו ב 30 מעלות צלזיוס.
במכסה המנוע של האדים, הוסיפו מתנול השווה ל-30 עד 50% מנפח הדגימה המיועד לצינור של 15 מיליליטר. סוגרים את הצינורות בחוזקה, מתייגים אותם ומ מניחים אותם על קרח יבש כדי לצנן. לאחר מכן, סמן צינורות 1.5 מיליליטר לאחסון ארוך טווח של הדגימות והנח על קרח כדי להתקרר.
מצננים לפחות מיליליטר מים לדגימה על קרח. לאחר שהצפיפות האופטית של המטרה לתחילת הדגירה המוקדמת הושגה, העבר דגימה לצינור המוכן מראש המכיל מתנול קר. הפוך את הצינור לזמן קצר והחזר אותו על קרח יבש.
זוהי דגימת הבקרה הלא-מיופקדת. מיד, מוסיפים את בטא אסטרדיול כך הריכוז הסופי הוא 10 מיקרומולר. מתערבלים במרץ כדי לערבב.
המשך לגדל את התרבות כבעבר, דגירה עם בטא אסטרדיול לזמן האופטימלי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. זמן הדגירה של בטא אסטרדיול הוא הצעד החשוב ביותר, ויש לייעל אותו עבור כל חלבון. קצר מדי והדלדול אינו שלם ואיטי.
יותר מדי זמן ורמות החלבון יירדו עוד לפני שתתווסף לאוקסין. פיפטה עד 0.5 microliters של רשות העתיקות למיליליטר של תרבות להוסיף מאוחר יותר. לאסוף מדגם מהתרבות undepleted כפי שתואר קודם לכן.
מיד מוסיפים את רשות העתיקות לריכוז סופי של 750 מיקרומולרים ומסתחררים במרץ כדי לערבב. התחל שעון זמן בהקדם האפשרי לאחר ערבוב. לאסוף דגימות על פי העיצוב הניסיוני.
לאחר מכן, מניחים את הדגימות על קרח. ודא שאף אחת מהדגימות לא קפאה. אם יש, בעדינות לחמם אותם ביד תוך היפוך מתמיד.
לאחר שכל הדגימות נאספות ולא קפואות, צנטריפוגה אותם ב 3, 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. יוצקים את מתנול תערובת בינונית ומניחים את הדגימות בחזרה על קרח. לאחר מכן, להשתמש שוב את גלולת התא במיליליטר אחד של מים ולהעביר את ההשעיה הזאת לצינור שכותרתו על קרח.
צנטריפוגה לזמן קצר במהירות מעל 15,000 פעמים G כדי להדוף את התאים. לאחר מכן, מניחים את הצינורות בחזרה על הקרח ושווים את הנוזל. במחקר זה, השפלה מכוונת כדי להשיג דלדול חלבון ספציפי ויעיל מבלי להשפיע אחרת על חילוף החומרים של תא השמרים.
חלבוני Prp2 ו-Prp22 בעלי שפע נמוך מתרוקנים עד פחות מ-20% לאחר 20 דקות של טרום דגירה עם בטא אסטרדיול, ואחריו 15 דקות עם אוקסין. זמני טרום דגירה ארוכים יותר מובילים לדלדול מהיר יותר, אך גם מראים דלדול חלבון לא רצוי לפני תוספת אוקסין. לשם השוואה, Dcp1 שופע יותר מתרוקן רק כ 30% עם אותו טיפול.
עם זאת, 60 דקות של זמן הדגירה מראש גורמות לדלדול ל -13% עם אותו טיפול עזר במחיר דלדול לפני הוספת הauxin. מטב את זמן הדגירה מראש ואל תאבד את תחושת הזמן בין נקודות הזמן שלך. מה לעשות הלאה תלוי בשאלה שלך.
גילינו שדגימה של 10 מיל של תרבות מספיקה לחלבון, דנ"א או ניתוח רנ"א. הליך הדגימה ניתן להתאמה בקלות גם עבור ChIP. עכשיו יש דרך מהירה וסותרת לרוקן חלבונים.
אז הפונקציה אפילו של חלבונים חיוניים ניתן למצוא. הפרוטוקול די בטוח. מתנול הוא הכימיקל המסוכן היחיד.
יש לדאוג בעת חלוקתו. לעשות את זה ברדס אדים, וללבוש שני זוגות של כפפות, כמו מתנול יכול לעבור את רוב כפפות ניטריל.
