Una técnica común para averiguar la función de una proteína es eliminarla y ver qué sucede. Pero no puedes hacer eso con una proteína esencial. Es esencial, la célula muere.
Así que necesitas una manera de eliminar esa proteína y echar un vistazo a lo que sucede justo antes de la muerte celular. El agotamiento de proteínas debe ser rápido, por lo que no se obtienen efectos secundarios. Debe ser específico, de modo que sólo esa proteína se elimina y sólo se agota cuando se quiere que sea.
Y no debe afectar a la célula de ninguna otra manera que no sea la eliminación de esa proteína. Después de preparar la cepa, utilice un cultivo nocturno para determinar qué dilución se necesita. Utilice esta información para configurar una nueva cultura suficiente con un OD600 entre 0,1 y 0,2, y crecerlo a 30 grados centígrados.
En una campana de humo, agregue un metanol equivalente a 30 a 50% del volumen de muestra previsto a un tubo de 15 mililitros. Cierre bien los tubos, etiquete y colóquelos sobre hielo seco para enfriar. A continuación, etiquete los tubos de 1,5 mililitros para el almacenamiento a largo plazo de las muestras y colóquelos en hielo para enfriar.
Enfríe al menos un mililitro de agua por muestra sobre hielo. Una vez alcanzada la densidad óptica objetivo para el inicio de la pre-incubación, transfiera una muestra al tubo pre-preparado que contiene metanol frío. Invierta el tubo brevemente y colóquelo de nuevo sobre hielo seco.
Esta es la muestra de control no inducida. Inmediatamente, añadir el beta-estradiol de tal manera que la concentración final sea de 10 micromolares. Gire vigorosamente para mezclar.
Continúe creciendo el cultivo como antes, incubando con beta-estradiol durante el tiempo óptimo como se describe en el protocolo de texto. El tiempo de incubación de betaestradiol es el paso más importante, y debe optimizarse para cada proteína. Demasiado corto y el agotamiento es incompleto y lento.
Demasiado largo y los niveles de proteína caerán incluso antes de que hayas añadido la auxina. Pipetear hasta 0,5 microlitros de IAA por mililitro de cultivo para añadir más tarde. Recopile una muestra de la referencia cultural sin descarar como se describió anteriormente.
Añadir inmediatamente el IAA a una concentración final de 750 micromolares y girar vigorosamente para mezclar. Inicie un temporizador tan pronto como sea posible después de mezclar. Recoger muestras de acuerdo con el diseño experimental.
A continuación, coloque las muestras en hielo. Asegúrese de que ninguna de las muestras se haya congelado. Si alguno lo tiene, caliente suavemente en la mano mientras invierte constantemente.
Una vez que todas las muestras se recogen y no se congelan, centrifugarlas a 3.500 veces G y cuatro grados centígrados durante dos minutos. Vierta el metanol y la mezcla media y vuelva a colocar las muestras sobre hielo. Luego, resuspender el pellet celular en un mililitro de agua y transferir esta suspensión a un tubo etiquetado sobre hielo.
Centrifugar brevemente a una velocidad superior a 15.000 veces G para repeler las células. Después de esto, coloque los tubos de nuevo sobre hielo y aspire el líquido. En este estudio, la degradación se ajusta para lograr un agotamiento de proteínas específico y eficiente sin afectar de otro modo el metabolismo de la célula de levadura.
Las proteínas Srp2 y Prp22 de baja abundancia se agotan a menos del 20% después de 20 minutos de pre-incubación con beta-estradiol, seguido de 15 minutos con auxina. Los tiempos de pre-incubación más largos conducen a un agotamiento más rápido, pero también muestran un agotamiento indeseable de proteínas antes de la adición de auxina. En comparación, el Dcp1 más abundante sólo se agota a aproximadamente 30% con el mismo tratamiento.
Sin embargo, 60 minutos de tiempo de pre-incubación dan lugar a un agotamiento del 13% con el mismo tratamiento de auxina a costa del agotamiento antes de añadir la auxina. Optimice el tiempo de pre-incubación y no pierda la noción del tiempo entre sus puntos de tiempo. Lo que debe hacer a continuación depende de su pregunta.
Hemos descubierto que la muestra de 10 mils de cultivo es suficiente para el análisis de proteínas, ADN o ARN. El procedimiento de muestreo también es fácilmente adaptable para ChIP. Ahora hay una forma rápida y específica de agotar las proteínas.
Así que la función incluso de las proteínas esenciales se puede encontrar. El protocolo es bastante seguro. El metanol es el único químico peligroso.
Tenga cuidado mientras lo dispensa. Hazlo en una campana de humo, y usa dos pares de guantes, ya que el metanol puede atravesar la mayoría de los guantes de nitrilo.
