פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום לסטטוזיס של כלי רכב בכבד בתאי HepaRG מובחנים ושיטות לגילוי וכמות של הצטברות שומנים. מודל תאים אנושי במבחנה זה מייצג חלופה בעלת ערך למודלים של עכברי vivo ולהפטוציטים אנושיים ראשוניים. להפשיר חנקן cryopreserved קבוצה מעבר נמוך של תאי HepaRG על ידי טבילת אותם באמבטיה 37 מעלות צלזיוס עד מופשר.
מעבירים במהירות את התאים לצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מדיום מתרבה. לאחר צנטריפוגה במשך חמש דקות, להשליך את supernatant ולתלות את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום מתרבה. לספור את התאים לדלל על מנת צלחת 250, 000 תאים לכל סנטימטר מרובע.
צלחת התאים על 100 מילימטר תאים תרבות מנות ולחדש את המדיום כל יומיים או שלושה. התאים מתרבים עם זמן הכפלה של כ-24 שעות. לאחר שתאי HepaRG מגיעים ל-80%, נתק אותם באמצעות דגירה של שלוש עד חמש דקות עם תווי טריפסין של 0.05%.
לאסוף את התאים בינוני מתרבה צנטריפוגה במשך חמש דקות כמו קודם. השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש את התאים עם חמישה מיליליטר של מדיום מתרבה. שוב, לספור את התאים לדלל על מנת צלחת 250, 000 תאים לס"מ מרובע.
בשלב זה, להגביר את התאים על ידי חזרה על שלבים אלה כדי להגיע למספר מתאים של תאים כדי להתחיל ניסויים. כדי cryopreserve תאי HepaRG, לנתק את התאים 24 שעות לאחר ציפוי דרך דגירה שלוש עד חמש דקות עם 0.05% פתרון טריפסין. לאסוף את התאים בינוני מתרבה צנטריפוגה במשך חמש דקות כמו קודם.
השלך את העל-טבעי, תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד לכל אצווה של מדיום מקפיא, והקפא את האצוות בחנקן נוזלי. ביום אפס, זרעי HepaRG תאים ב 250, 000 תאים לס"מ מרובע לתוך מנות שטופלו בתרבות עם נפח מתאים של מדיום התפשטות. שתי מנות צריכות להיות מצופות עבור כל תצהר, אחת עבור תאי בקרה ואחד עבור תאים שטופלו באולט.
ביום השני והיום הרביעי, לשנות את המדיום עם נפח מתאים של מדיום התפשטות ולתת לתאים לגדול עד שהם מגיעים למנזר. ביום השביעי, התאים חייבים להיות 100%confluent. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS 1X.
לאחר מכן, הסר את ה- PBS 1X והוסף אמצעי אחסון מתאים של אמצעי בידול. בימים 8, 9, 12, 15 ו- 18, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1X PBS לפני הוספת נפח מתאים של מדיום בידול. ביום 21, להתבונן בתאי HepaRG תחת מיקרוסקופ ולהבטיח כי התאים הם תרבויות מובחנות confluent.
כפקד, לקצור צלחת בקרה אחת כדי לבצע ניתוח ביטוי גנים של גנים סמן ההידול. ביום 21, תאי HepaRG מובחנים יכולים להיות cryopreserved בחנקן נוזלי. ביום 21, לדלל נתרן oleate עם נפח מתאים של מדיום התברואה מלאה לריכוז סופי של 250 micromolar.
הוסף 99% מתנול ביחס של 1 עד 400 לתוך aliquot אחר של מדיום ההתברכות כדי להפוך את הטיפול בקרת הרכב. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS 1X ולהוסיף רכב או נתרן oleate בינוני. ביום 23 ויום 25, לשנות את המדיום עם הנפח המתאים של מדיום מוכן טרי.
ביום 26, להתבונן בתאים על ידי מיקרוסקופ אופטי. טיפות שומנים מצטברים בתאים המטופלים נתרן oleate והם נראים בקלות כמו טיפות שקופות בציטופלסמה. כדי לבצע כתמי שמן אדום O, תחילה לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS 1X ולהסיר את PBS 1X לחלוטין.
הוסיפו 4% פרפורמלדהיד ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את paraformaldehyde ולשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS. לאחר הסרת PBS, הדגירה את התאים עם 60% isopropanol במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
הסר את isopropanol ולתת לתאים להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר. עכשיו להוסיף שמן אדום O פתרון עבודה לתאים דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. נפח פתרון העבודה הנדרש עבור כל מדגם תואם לנפח המדיה המשמשת לפולחן התאים.
הסר את פתרון שמן אדום O ומיד להוסיף מים מזוקקים כפול. לאחר שטיפת התאים ארבע פעמים במים מזוקקים כפולים, רכשו תמונות מתחת למיקרוסקופ לניתוח. כדי לסלק את צבע שמן אדום O, להסיר את כל המים ולאפשר להתייבש.
לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של 100% isopropanol ודגירה במשך 10 דקות עם רעידות עדינות בטמפרטורת החדר. פיפטה isopropanol עם שמן eluted אדום O צבע למעלה ולמטה מספר פעמים, להבטיח כי כל שמן אדום O הוא בפתרון. העבר את הפתרון ל cuvette.
למדוד את הצפיפות האופטית ב 500 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטריה ולהשתמש 100% isopropanol כמו ריק. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS 1X. לאחר מכן, דגירה עם 100 nanomolar של בודיפי מדולל ב 1X PBS בחושך במשך 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
יש לכלול פקד שאינו נגוע במדידות ציטומטריית הזרימה. הסר את פתרון הכתמים ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS 1X. לאחר מכן, לשטוף את התאים שוב ולהסיר את PBS לחלוטין.
הוסיפו 4% פרפורמלדהיד ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את paraformaldehyde ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות PBS. תאים ניתן לשמור PBS 1X בארבע מעלות צלזיוס או בתמונה מיד.
לאחסון, יש לעטוף עם Parafilm ולכסות בנייר אלומיניום כדי למנוע מהתאים להתייבש. כדי לאמת אינדוקציה יעילה של סטאטוזיס, תאי HepaRG שטופלו באולאטים ושולטים היו מוכתמים בצבע שמן אדום O. לאחר הכתם, טיפות השומנים נראות בקלות כ טיפות אדומות.
כתמים ניתן לכמת על ידי מדידה ספקטרופוטומטרית של שמן R O צבע eluted עם איזופרופנול. ספיגת שמן אדום O מהתאים היא פרופורציונלית ישירות להצטברות טיפת השומנים הציטופלזמית. ריכוז נתרן oleate ותזמן החשיפה נקבעו על ידי MTT עיוורון הכדאיות לתאים צבעוניים.
המוצר Formosan הוא כימת על ידי ספיגתו ב 490 ננומטר והוא פרופורציונלי ישירות למספר התאים החיים בתרבות. טיפול נתרן oleate הושווה לטיפול נתרן פלמיטט. התרופה האפטוטית טוקסורוביצין שימשה כבקרה.
כדי לכמת את הגידול של תוכן השומנים הסלולר לאחר טיפול נתרן oleate, כתמים עם צבע Bodipy שימש כדי לתייג טיפות השומנים. באמצעות ניתוח ציטופלורומטרי, ניתן לכמת את תוכן הטריגליצרידים על ידי עוצמת פלואורסצנט ממוצעת של בודיפי, הגבוהה יותר בתאים שטופלו באולט בהשוואה לתאי בקרה. זה מצביע על הצטברות שומן יעילה לאחר טיפול oleate.
ואכן, תמונות של תאים מוכתמים בבודיפי מראות טיפות שומנים פלואורסצנטיות ירוקות בהירות בתאים שטופלו באולט שאינם גלויים בתאי הבקרה. כדי לאפיין עוד יותר את הצטברות טיפות השומנים לאחר טיפול נתרן oleate, MICROSCOPY CARS יכול להתבצע כמתואר בפרוטוקול הטקסט המאפשר כימות טיפות השומנים ללא תיוג. מודל זה המבוסס על תאים עשוי להגביר את הידע של המנגנונים המולקולריים המעורבים במחלת כבד שומני לא אונקוטית ועשוי להוביל לפיתוח סמנים חדשים לאבחון מוקדם ואסטרטגיות טיפול חדשות.
