פרוטוקול זה מדגים את התועלת של מערכת האורגנואידים במעיים שמקורה בתאי גזע למודל פלישת אפיתל על ידי פתוגנים אינטיים, ושינוי של תהליך זה באמצעות ציטוקיני. מיקרו-הזרקה מאפשרת לפתוגן של עניין להיות מועבר ישירות לתוך חלל lumenal של האורגנואיד, משכפל מקרוב יותר את תהליך הזיהום ב vivo. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של פתוגנים אנתיים שונים או ציטוקינות חלופיות של עניין.
הייתי מציע להשלים ניסוי של ההליך עם פנול אדום רק כדי לשלוט בטכניקת המיקרו-הזרקה לפני השימוש בפתוגנים. ביום השני, להתחיל את ההידול על ידי שינוי התקשורת ל 10 מיליליטר של מדיום תרבות תאי גזע, בתוספת גורמי גדילה. ביום השישי, לשנות את התקשורת ל 10 מיליליטר של מדיה RPMI-B27, בתוספת שישה micromolar CHIR99021, בתוספת שלוש חומצה רטינואית מיקרומולרית להתחיל דפוס endoderm האחורי כדי hindgut.
ביום ההידול 10, הטמיעו את ההינדגוט במטריצת קרום המרתף. ראשית, להסיר את המדיה מהצלחת האחורית, ולשטוף את הצלחת עם DPPS ללא מגנזיום סידן פעם אחת. מוסיפים חמישה מיליליטר של תותב קולגן לצלחת ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לאחר מכן, להשבית את הקולגנס על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיה צמיחה בסיס organoid לצלחת. התאים האחוריים צריכים להיות צפים בשלב זה. לאסוף את ההשעיה האחורית בצינור חרוט 15 מיליליטר.
ואז צנטריפוגה ב240 פעמים G לדקה אחת. לאחר צנטריפוגה, פיפטה את supernatant, להוסיף 10 מיליליטר של מדיה צמיחה בסיס organoid, לשבור את hindgut לחתיכות קטנות יותר על ידי צינור בעדינות, צנטריפוגה שוב ב 95 פעמים G לדקה אחת. לשטוף את התאים במדיה צמיחה בסיס אורגנואיד פעמיים.
יש להשתמש מחדש בתאים ב-300 עד 500 מיקרוליטרים של מדיום צמיחת הבסיס, ולהוסיף כ-100 מיקרוליטרים של פתרון זה ל-1.5 מיליליטר של מטריצת קרום המרתף. הגדר צלחת 24 באר על תנור צלחת ב 37 מעלות צלזיוס. ולתהות 60 microliters של תערובת מטריצת התא האחורי לתוך באר אחת של צלחת 24 היטב.
אפשר לו להגדיר בקצרה ולבדוק את הצפיפות תחת מיקרוסקופ. לאחר איתור שאר המטריצה לתוך הצלחת 24 היטב, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו 800 מיקרוליטרים של מדיית הצמיחה הבסיסית המכילה גורמי גדילה לכל באר של צלחת 24 בארות.
כדי לעבור אורגנואידים, תחילה להסיר את התקשורת מהם, ולהחליף אותו עם 500 microliters לכל באר של פתרון הרמת התא. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 40 עד 50 דקות, ובנקודה זו האורגנואידים צריכים להיות צפים בתסומה. בעדינות pipette האורגנואידים ואת פתרון הרמת התא לתוך צינורות חרוט 15 מיליליטר, מנסה לא לשבור את האורגנואידים.
לאחר מתן אפשרות האורגנואידים להתיישב במשך שלוש עד חמש דקות, להסיר את העל-טבעי ואת התאים הבודדים. תן שוב את האורגנואידים בחמישה מיליליטר של מדיום הצמיחה הבסיסי, וצנרת אותם בעדינות לשטוף. צנטריפוגה ב95 פעמים G במשך שתי דקות.
לאחר מכן, להגדיר את הצלחת 24 גם על תנור צלחת ב 37 מעלות צלזיוס בתוך מכסה המנוע, ולהסיר את supernatant מכדור organoid. לאחר מכן, באמצעות פיפטה P1000, תן שימוש חוזר באורגנואידים ב-300 עד 500 מיקרוליטרים של מדיית הצמיחה הבסיסית כדי לפרק את האורגנואידים לגושים קטנים יותר. מניחים כ -100 microliters של האורגנואידים לתוך 1.5 מיליליטר של מטריצת קרום המרתף פיפטה לזמן קצר לערבב.
ספוט החוצה 60 microliters של מטריצת קרום המרתף לתוך באר אחת של צלחת 24 באר. לאחר שעזב אותו כדי לחזק במשך 30 שניות, לבדוק את הצפיפות מתחת למיקרוסקופ. לאחר איתור שאר המטריצה לתוך צלחת 24 באר, מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולאחר מכן כיסוי זה עם 800 microliters של מדיום הצמיחה הבסיס עם גורמי גדילה על פי כתב היד.
למיקרו-הזרקה עם גירוי טרום-גירוי אנושי רקומביננטי IL-22, הוסיפו את ה-IL-22 האנושי הרקומביננטי למדיית התרבות לריכוז סופי של 100 ננוגרם למיליליטר 18 שעות לפני הזריקות. טוענים את צלחת המיקרו-הזרקה המכילה אורגנואידים לשלב המיקרוסקופ, מסירים את המכסה ומביאים את האורגנואידים לפוקוס, מוכנים להזרקה להתחיל. הפעל את המזרק ואת תחנות בקרת הזרוע.
ודא המזרק מוגדר ללחץ של 600 קילופסקלים ותזמן הזרקה של 0.5 שניות. אם הוא עדיין לא נסוג מהשלב במיקרוסקופ, סובב את זרוע ההזרקה כדי לוודא שהיא, והסר את ראש האחיזה שלה. לטעון את קצה המקדחה עם 10 microliters של inoculum, אוחז את קצה המקדח בעדינות בקצה הקהה שלה.
מניחים את קצה המקדחה לתוך ראש האחיזה ומחיבים אותו מחדש לזרוע המיקרו-הזרקה. בעדינות להזיז את הזרוע למצב שבו המחט ממוקמת אחד עד שני סנטימטרים מעל צלחת מיקרו הזרקת. השתמש בבקרת הזרוע כדי למקם את קצה המחט במרכז המנה, ולהוריד אותו עד שהוא רק על פני השטח של התקשורת.
תכנת את תחנת בקרת הזרוע להחזיר את המחט לנקודה זו לאחר כל הזריקות. למקד את המיקרוסקופ על האורגנואידים ולבחור את המטרה להזריק. מקם את המחט ממש מעל ואת הזכות של organoid להיות מוזרק, ולהזיז את המחט כלפי מטה ובדרך אגב לתוך לומן organoid.
לחץ על כפתור ההזרקה על מזרק מיקרו כדי לאפשר את תערובת חיידקים מוכתמים פנול לצאת מן המחט. ולהזריק כל אורגנואיד שלוש פעמים. כאשר כל האורגנואידים הנדרשים מוזרקים, מוציאים את צלחת המיקרו-הזרקה מהשלב, מחליפים את המכסה ודורגים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
לאחר הדגירה, שאפו את אמצעי הגדילה והחליפו אותה בשלושה מיליליטר של פתרון הרמת תאים. לאחר מכן, דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לאחר מכן, הזז בעדינות את האורגנואידים ואת פתרון הרמת התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של DPBS.
צנטריפוגה ב370 פעמים G במשך שלוש דקות. הסר את supernatant, ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיה צמיחה הבסיס המכיל 0.1 מיליגרם למיליליטר ג'נטמיצין. לאחר מכן, עם P1000, פיפטה למעלה ולמטה כ 50 פעמים כדי לשבור את האורגנואידים.
הוסף ארבעה מיליליטר יותר מדיה, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת להרוג חיידקים חוץ תאיים. לאחר מכן, צנטריפוגה האורגנואידים ב 370 פעמים G במשך שלוש דקות. שאף את העל-טבעי, והשאיר כמה שפחות.
לשטוף את האורגנואידים עם DPBS פעם אחת צנטריפוגה שוב. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מאגר התיזה, ואת פיפטה למעלה ולמטה כ -50 פעמים כדי לנטרל באופן ידני את האורגנואידים במעיים האנושיים. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, מדללים באופן סדרתי את הפתרון המתקבל פי עשרה ב- DPBS.
פיפטה שלוש טיפות 20 מיקרון של פתרונות מסודרים ומדוללים על צלחות אגר LB מחוממות מראש. לבסוף, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה ולהמשיך עם ספירת מושבה. האורגנואידים במעיים האנושיים הוזרקו מיקרו עם תסכולת החיידקים האדומים של פנול.
שמירה על צבע אדום זה על ידי האורגנואידים מונעת זריקות כפולות. טיפול מקדים באורגנואידים במעיים האנושיים הנגזרים מהקו התאי COF-2 עם IL-22 אנושי רקומביננטי מגביל את הפלישה של S.typhimurium SL1344 לתאי אפיתל מעיים. אורגנואידים נגועים עובדו עבור כתם חיסוני, או מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, על מנת להקל על הדמיה של אינטראקציות חיידקיות של חברת החשמל המארחת.
RNA ניתן לחלץ מן האורגנואידים מוזרק להסתכל על תגובה transcriptomic לזיהום. פלואורסצנטיות מיקרוסקופ אלקטרונים יכולים לשמש גם כדי לצפות אינטראקציות פתוגן המארח בפירוט רב יותר. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא להבטיח כי היה לך מספיק תרגול על מזרק מיקרו כדי להיות מסוגל להשלים את הזריקות שלך במהירות וביעילות לתוצאות עקביות.
טיפים מקדחת מיקרו הזרקת יש נקודה עדינה, חדה, ויש לנקוט בזהירות בעת טעינה ופריקה שלהם מן מזרק מיקרו. טכניקה זו מאפשרת אינטראקציות פתוגן תא אפיתל להיחקר בפירוט בלתי ניתן להשגה בעבר. מודל זיהום זה יהיה שימוש מיוחד לאלה הלומדים פתוגנים ספציפיים לאדם.
