פרוטוקול זה הוא משמעותי משתי סיבות עיקריות. מספר אחד, זה מאפשר למשתמש להיות מסוגל לקבוע את מצבי מחזור התא של תאי העור שבודדו ממודל של בעלי חיים. זה גם מאפשר לנו להיות מסוגלים לנתח ביטוי חלבון בשלבים הדיסקרטיים של מחזור התא.
בהשוואה לשיטות קודמות לקביעת התפשטות תאים, השיטה שלנו מאפשרת קביעה מדויקת יותר של השלבים השונים במחזור התאים, ואנחנו יכולים גם לנתח יותר מ -40 סמנים שונים בשלבים השונים של חלוקת התאים. זה משפר מאוד את היישום ואת הרבגוניות של השיטה. פרוטוקול זה עשוי לשמש בחקר הסרטן ובכל סוג אחר של מחלה שבו יש צורך לקבוע מחזור התא דפוסי ביטוי חלבון ספציפיים.
בנוסף, ניתן לשנות פרוטוקול זה לסוגי תאים אחרים ולאורגניזמים אחרים במודלים. המשתמש בפעם הראשונה צריך להתמקד מקבל את ההכנה התא באיכות הטובה ביותר האפשרית. זה דורש עיבוד בזמן של עור ניסיוני באמצעות reagents טרי, זמן עיכול רקמות מינימלי, וסילוק זהיר של supernatant לאחר צנטריפוגה כדי לשמור על שלמות וכמות התאים.
ראשית, תכנן פאנל נוגדנים מתויג במתכת באמצעות תוכנת עיצוב פאנל מקוונת חינמית, כמתואר בכתב היד. לאחר מכן הכינו פתרון מלאי IdU על ידי המסת אבקת IdU ב-10 מיליגרם למיליליטר ב-0.1 נתרן הידרוקסידי רגיל ב-60 מעלות צלזיוס. לאחר aliquoting פתרון מלאי IdU לתוך צינורות microcentrifuge, להקפיא אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
מיד לפני השימוש, להתאים את ה- pH של פתרון IdU ל 7.5 עם 12 חומצה הידרוכלורית נורמלית, ולבדוק עם רצועת pH על aliquot להשליך כדי להבטיח את הפתרון הוא ב pH 7.5. כדי להכין פתרון תיקון פרפורמלדהיד x, לשלב חמישה מיליליטר של 10 x PBS ומיליליטר אחד של 16% PFA עם 44 מיליליטר של מים מזוקקים מולקולריים טהורים. כדי להכין 100 מילימולרי ציספלטין פתרון מלאי, להמיס 300.5 מיליגרם של אבקת ציספלטין ב 10 מיליליטר של DMSO.
לניסויים שישמשו במשך יום אחד, הכינו פתרון עבודה של 10 מילימולרים. לשקול עכברים ולאחר מכן לקבוע מנה ב 0.1 מיליגרם של IdU לגרם של משקל גוף. לנהל את המינון המחושב של IDU על ידי הזרקה תוך-לידתית, ולחכות שעתיים לפני קצירת תאים.
השתמש זוג מספריים כיתה כירורגית כדי להסיר בניתוח את האוזן של העכבר המתת חום שהוזרק בעבר עם IdU בבסיס האוזן. מניחים את האוזן על צלחת פטרי יבשה 100 מילימטר. בזהירות להפריד את הקדמי מן העור האחורי באמצעות ממטרים עדין כדי ליצור כיס באמצע או בקצה של האזור לחתוך, ולאחר מכן למשוך את שני מדפים העור לגזרים, ולהמשיך עם העור הקדמי והן האחורי.
בזהירות למקם את העורות האחוריים והעורפיים של אוזן אחת באר אחת של צלחת תרבות 12-well, מלא מיליליטר אחד של פתרון dispase / קולגן מוכן טרי, עם הצד derma של העור נוגע בתסכה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לעכל את העור. מניחים את האוזן מתעכל או עור יילודים בצלחת פטרי נקי עם הצד epidermis נוגע על פני השטח של המנה.
באמצעות מדפים, לשטח את העור בעדינות להחליק את הדרמיס את האפידרמיס על ידי עבודה מהמרכז אל הקצוות בתבנית מעגלית. עם מטחנות, לתפוס את האפידרמיס בקצוות בעדינות להרים אותו על ידי קילוף אותו מפני השטח של צלחת פטרי. בזהירות למקם את האפידרמיס על פתרון ניתוק תאים מחומם מראש באר אחת של צלחת.
דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס או 20 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש מדפים סטריליים כדי לתפוס את האפידרמיס לשפשף על ידי גרירת האפידרמיס נגד החלק התחתון של המנה כדי לנטרל תאים. הוסף מיליליטר אחד של DMEM המכיל 1%FBS, ועובר דרך מסנון תא 40 מיקרומטר לתוך צינור איסוף.
יש לשטוף היטב עם שני מיליליטר נוספים של DMEM ולהוסיף המתלה התא. לאחר צנטריפוגה ב 120 פעמים g במשך חמש דקות, בזהירות לשאוף את supernatant. תן שוב את גלולת התא באחד עד שני מיליליטר של DMEM המכיל 1%FBS, ו גלולה את התאים שוב כמו קודם לכן.
כדי לתייג תאים כדי לקבוע תאים חיים ומתים, התן מחדש אחד עד שלושה מיליון תאים במיליליטר אחד של DMEM המכיל 25 ציספלטין מיקרומולרי ודגירה למשך דקה אחת. הרווה על ידי צינור עם נפח שווה של FBS. לאחר צנטריפוגה ב 120 פעמים g במשך חמש דקות, decant את supernatant לתוך מקור המכיל אקונומיקה מדוללת, ולהפוך את הצינורות כדי לנקז את הפתרון הנותר על מגבת נייר.
תן את גלולת התא בשני מיליליטר של PBS ללא יון בריום, וצנטריפוגה אותם שוב כפי שתואר קודם לכן. כדי לתקן את התאים, תן שימוש חוזר לכדור התא במיליליטר אחד של PBS ללא יון בריום. Vortex התאים תחת כוח נמוך מתמשך ולהוסיף מיליליטר אחד של שני x PFA קיבעון מאגר טיפה חכם.
מניחים על פלטפורמת נדנדה ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות, בזהירות decant את supernatant. לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS ללא יון בריום, צנטריפוגה שוב באותם תנאים, ולחזור על שלב הכביסה.
לבסוף, תן שימוש חוזר את גלולה בשני מיליליטר של PBS ללא יון בריום. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות בזהירות decant את supernatant. תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מאגר קיבוע x אחד, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות וחזור על הצנטריפוגה.
כדי לשטוף את התאים, להוסיף מיליליטר אחד של מאגר permeabilization ברקוד. במהלך צנטריפוגה התא ב 500 פעמים g במשך חמש דקות, להכין ברקודים על ידי הוספת 100 microliters של מאגר permeabilization ברקוד להם, ומערבבים מיד. תן שימוש חוזר לכדור התא ב-800 מיקרוליטרים של מאגר חדירות ברקוד.
מוסיפים תווי ברקוד לתאים, מערבבים ומטגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. לשטוף תאים בשני מיליליטר של חיץ כתמי תאים וצנטריפוגה שוב.
לאחר מכן, תן שימוש חוזר של 1 עד 3 מיליון תאים במיליליטר אחד של חיץ כתמי אנטיגן גרעיניים עובד פתרון עבודה, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות, בזהירות decant את supernatant. תן שוב את התאים במיליליטר אחד של חיץ זיכרון מחלחל מכתים אנטיגן גרעיני וצנטריפוגה שוב.
לאחר שימוש חוזר וצנטריפוגה, יש לעכל מחדש את גלולת התא בנפח שיורית עם מערבולת עדינה. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים תאיים, מערבבים ודולרים בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. הוסף שני מיליליטר של מאגר כתמי תאים.
צנטריפוגה שוב באותם תנאים כמו בשלב הקודם, ולהסיר את supernatant. תן שוב את גלולה בשני מיליליטר של חיץ כתמי תא, צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות, ולחזור על resuspending וצנטריפוגה. יש להשתמש מחדש בתאים במיליליטר אחד של פתרון חישוב הדדי, ולאחסן במשך יום עד שלושה ימים בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר צנטריפוגה של התאים שוב, לשטוף את גלולה עם שני מיליליטר של חיץ כתמים התא, צנטריפוגה באותם תנאים, ולבצע שתי שטיפות נוספות עם שני מיליליטר של מים, עם צנטריפוגה זהה. תן שוב את גלולת התא בריכוז של מיליון תאים למיליליטר עם פתרון חרוז EQ מדולל, ולאחר מכן להפעיל את הדגימות על ציטומטר המסה. תפוקות תאים צפויות וכדאיות מאוזן עכבר בוגרת ועור יילודים נקבעים.
התשואה המשוערת תלויה בשטח הפנים של העור. עור יילודים הוא בחירה טובה יותר עבור ניסויים הדורשים מספר גדול יותר של תאים. מוצגת אסטרטגיית הגט הבסיסית לבחירת תאים שלמים, יחידים ובת קיימא, לאחר נורמליזציה ותיעוב של נתוני ציטומטריית מסה מקודדת.
אחוז התאים בני קיימא עשוי להצביע על האיכות או המצב של התאים לפני הכתם. הבדלים בכדאיות בין תאי קרצינומה מתורבתים לעומת תאי אוזניים מבודדים של העכבר מוצגים גם כן. תאים בני קיימא היו מגודרים באורך אירוע לעומת CD45 כדי לא לכלול תאים hematopoietic.
הכללת סמני שושלת מאפשרת בחירת אוכלוסיות תאים מעניינות בשלבים שונים של מחזור התאים. פרופיל מחזור התא הבסיסי מתקבל על ידי זיהוי של BrdU לעומת PI בציטומטריית זרימה מבוססת פלואורסצנטי. עם זאת, הכללה של סמני התפשטות אחרים עם ציטומטריה המונית, מאפשר זיהוי מדויק יותר של שלבי מחזור התא.
בעקבות גישה זו, ניתן לבנות פרופילי מחזור תאים עבור סוגי תאים שונים או עבור תנאים ניסיוניים שונים, כגון הפרופילים עבור CD45 שלילי לעומת CD45 תאים חיוביים מאותו ניסוי. בדוגמה אחרת, ניתוח סמנים המגדירים את מסלולי האיתות של EGFR ו- mTOR PI3K בשלב G-One, חשף פרופילי ביטוי דומים בתאים שליליים CD45, המוצגים בתאים כתומים ו- CD45 חיוביים, המוצגים בכחול. ציטומטריה המונית דורשת הרבה תאים באיכות גבוהה.
אם משתמש מעוניין באוכלוסיית תאים נדירה, ייתכן שיהיה צורך במספר גבוה יותר של תאים. תאים חיים מבודדים יכולים לשמש לניתוח DNA או RNA, מחקרים ביוכימיים, או ניתן להשתמש בתרבות הרקמות לפני הקיבעון וכתמים עבור ציטומטריה המונית. המשתמש צריך להשתמש בציוד הגנה אישי ארון בטיחות בעת הצורך, בעת עבודה עם paraformaldehyde, חומצה הידרוכלורית, או נתרן הידרוקסיד.
